1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
水稻（oryza sativa l.）是世界性的粮食作物，在我国的粮食生产中占有重要地位。
2009年，抗虫转基因水稻“bt汕优63”和“华恢1号”获得了农业部授予的生产安全证书，说明转基因水稻在我国具有良好的商业化种植前景（chen 等, 2011）。
经过努力还成功培育出具有良好商业化前景的抗虫抗除草剂复合性状的转基因水稻品种。
2. 研究的基本内容和问题
1，研究目标本实验以t2a-1和受体水稻明恢mh63分别作为父母本与泰州杂草稻的杂交f2为试验材料。
通过测定供试材料在单种自然虫压下的营养生长和生殖生长指标，评估抗性f2（f2 和rf2 分别表示以t2a-1为父本和母本的f2）与未携带抗性基因的f2（f2-和rf2-分别表示以mh63为父本和母本的f2）或相应杂草稻的适合度。
目的是进一步评估商业化种植t2a-1后由于基因漂移可能引起的生态风险。
3. 研究的方法与方案
试验材料
复合性状转基因水稻T2A-1及其非转基因受体水稻明恢63（MH63）由华中农业大学提供，泰州杂草稻由本试验人员采集于江苏泰州（WRTZ）。T2A-1与泰州杂草稻正反向杂交的4种F2均由王园园（2019）试验中F1自交所得。
表1试验材料的来源及主要特征
| 试验材料
| 代号
| 来源
| 籼粳型
| 果皮颜色
| 芒 |
| 复合性状转基因水稻
| T2A-1 | 华中农业大学
| 籼型
| 白色 | 无 |
| 明恢63
| MH63 | 华中农业大学
| 籼型
| 白色 | 无 |
| 江苏泰州杂草稻
| WRTZ | 南京农业大学
| 偏籼型 | 红色 | 无 |
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| 材料
| 杂交方式 Hybrids(♀×♂) | 表示形式 Abbreviation |
| F2 | F2(WRTZ×T2A-1) | F2TZ |
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| F2(WRTZ×T2A-1) | F2TZ- |
| F2- | ||
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| ||
| RF2 | RF2(T2A-1×WRTZ) | RF2TZ |
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| RF2- | RF2 (MH63×WRTZ) | RF2TZ- |
表2 F2杂交组合及表示形式
2.研究方法
试验在南京农业大学牌楼试验基地网室内进行，经抗性筛选后，选择大小一致、生长健壮的幼苗进行移栽。试验共设7个处理（每种材料各为一个处理），每个处理重复4次，采用随机区组设计。小区面积为60cm×80cm，小区间距50cm。每个小区移栽20株，株间距20cm。试验期间对小区内的杂草进行人工拔出，保持无杂草状态，田间保持1-3cm水层，并在分蘖期和灌浆期分别施用一次高光效复合肥（450 kg/ha，江苏中东化肥股份有限公司）。试验过程中需要测量的指标见表3，具体测定指标及时间如下。
表3.试验过程中需要测量的指标
| 测定（取样）时期 | 测定指标 |
| 分蘖期 | 净光合速率 |
| 蛋白表达量 | |
| 孕穗期 | 靶标虫压 |
| 净光合速率 | |
| 灌浆期 | 蛋白表达量 |
| 黄熟期 | 株高 |
| 有效分蘖数 | |
| 剑叶面积 | |
| 收获后 | 穗长 |
| 结实率 | |
| 单穗饱粒数 | |
| 百粒重 | |
| 单株产量 | |
| 单株干生物量 | |
| 落粒率 |
2.1 T2A-1与泰州杂草稻杂交F2的抗性基因表达能力及其靶标虫压
2.1.1 cry2A*蛋白表达量
分别于分蘖期和灌浆期随机选取T2A-1及以T2A-1为亲本的F2各5株，并取其主茎剑叶置于液氮中，保存在-80℃的超低温冰箱，用于ELISA检测。用QualiPlate Kit for cry2A* (EnviroLogix Inc., Portland, ME, USA)试剂盒来定量测定复合性状转基因水稻T2A-1及以T2A-1为亲本的F2剑叶中的cry2A*的蛋白表达量。操作步骤严格遵循说明书，用酶标仪（TECAN, Infinate M2000, Switzerland）测定450nm波长下的吸光度值（OD）；测定不同浓度(0.5ng/ml、1ng/ml、1.5ng/ml、2ng/ml、2.5ng/ml)的cry2A*蛋白标准溶液的吸光度值，并绘制蛋白浓度与OD值的标准曲线，依据标准曲线和提取液稀释倍数计算T2A-1及以T2A-1为亲本的F2剑叶外源cry2A*蛋白含量（μg/g FW）。
2.1.2靶标虫压
水稻生长至孕穗期，以各处理小区的所有供试材料为调查对象，统计各区供试材料所有的卷叶数目、总叶片数、枯穗数目和有效分蘖数，计算靶标虫压指数（Xia 等,2011）。靶标虫压指数（%）=卷叶率 枯穗率，其中卷叶率（%）=卷叶数目/总叶片数，枯穗率（%）=枯穗数目/有效分蘖数。
2.2 T2A-1及MH63与泰州杂草稻杂交F2的净光合速率及营养生长能力
2.2.1 T2A-1及MH63与泰州杂草稻杂交F2的净光合速率
在水稻分蘖期、孕穗期，选择天气晴朗的天气于上午9:30-13:00测定各小区试验材料的净光合速率。每小区随机选取10株材料的主茎剑叶，用LI-6400便携式光合仪（美国LI-COR公司）测定净光合速率。
2.2.2T2A-1及MH63与泰州杂草稻杂交F2的营养生长能力
以单种小区T2A-1、MH63、WRTZ以及T2A-1或MH63与泰州杂草稻的正反向杂交F2为研究对象在黄熟期，测定株高、剑叶面积和有效分蘖数；在成熟后测定单株干生物量。具体的测定方法见表4。
表4.营养指标测定方法
| 生长阶段 | 测定指标 | 测定方法 |
| 营养生长
| 株高
| 每区随机选取每种供试材料20株，测量从土壤表面到主茎穗顶端的高度 |
| 有效分蘖数
| 每区随机选取每种供试材料20株，统计每株植株抽穗的分蘖数目 | |
| 剑叶面积
| 每区随机选取每种供试材料20株，测量主茎剑叶的长和宽，剑叶面积为：长×宽×0.75 | |
| 单株干生物量
| 每区随机选取每种供试材料20株，收获后统一在阳光下晾晒10天，称量水稻植株地面上部分整体的干重 |
2.3 T2A-1及MH63与泰州杂草稻杂交F2的生殖生长能力
在成熟后测定穗长、结实率、单穗饱粒数、百粒重、单株产量。具体测定方法见表5。
表5生殖指标测定方法
| 生殖生长
| 穗长 | 每区随机选取每种供试材料5株，测量主茎稻穗的长度 |
| 单穗饱粒数
| 每区随机选取每种供试材料5株，统计主茎稻穗的饱粒数目 | |
| 百粒重
| 每区随机选取每种供试材料5株，并称量100粒饱满种子的重量 | |
| 结实率
| 每区随机选取每种供试材料5株，统计主茎稻穗的饱粒数目和总粒数，结实率（%）为单穗的饱粒数与单穗的总粒数的比值 | |
| 单株产量
| 每区随机选取每种供试材料20株，称量单株全部稻粒的重量 |
2.4 T2A-1及MH63与泰州杂草稻杂交F2的落粒性
以单种小区T2A-1、MH63、WRTZ以及T2A-1或MH63与泰州杂草稻的正反向杂交F2为研究对象，每个小区随机选取5株，每株供试材料的主茎稻穗剪下后从1.5m处自由坠地，连续重复3次，统计脱落与未脱落的水稻饱满粒数，并计算落粒率（脱落饱满粒数/单穗总粒数）统计落粒率。
2.技术路线
3．可行性分析
（1）本实验导师多年来一直开展转基因水稻相关研究，对转基因水稻了解深入，有成熟的试验技术以及丰富的经验。并且承担了转基因生物新品种培育重大专项课题-转基因水稻环境安全评价技术项目，该研究是其中的一部分，具有经费支持。
（2）前期已经开展了T2A-1的生存竞争能力及其与3种杂草稻（广东茂名WRMM、湖南益阳WRYY和江苏泰州WRTZ）杂交F1的适合度研究，获得了研究基础和试验材料；
(3)本项目依托的实验室经过多年的转基因水稻研究，拥有完善的实验设备，以及丰富的转基因水稻和杂草稻的种植和管理经验，具备本试验所需的便携式光合仪、酶标仪等一系列仪器设备，试验人员也已熟练掌握仪器的使用。
(4)开展本项目的试验基地设备完善，具有能开展试验的网室，具有良好的隔离措施，有专人看护，具备开展试验的条件。4. 研究创新点
目前为止，国内对复合性状转cry2A*/bar基因水稻T2A-1及其对应的栽培稻与杂草稻的杂交后代的研究只开展了F1，本实验探究了复合性状转cry2A*/bar基因水稻T2A-1与泰州杂草稻杂交F2的适合度， 研究结果能为该转基因水稻申请安全证书提供试验依据。
5. 研究计划与进展
2019年05月-2019年06 月：种植复合性状转基因水稻t2a-1、其非转基因受体水稻明恢63（mh63）、泰州杂草稻、t2a-1及mh63分别与泰州杂草稻正反向杂交的4种f2并完成移栽。
2019年07月-2019年08月：分蘖期取样五次，测量净光合速率，蛋白表达量，并且施用一次肥料。
2019年09月：孕穗期测定统计各区供试材料所有的卷叶数目、总叶片数、枯穗数目和有效分蘖数，计算靶标虫压指数。
