1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、本课题意义：
细胞自噬（autophagy）是真核细胞的一种高度保守的胞内物质降解途径，对细胞的物质循环、代谢平衡、稳态维持以及病理调控等过程有着重要作用。v-atpase是存在于真核生物细胞膜及管泡细胞器膜上的一种质子泵转运复合物。v-atpase亚基缺失会影响自噬过程。研究v-atpase在细胞自噬中的作用及其分子机制机制有利于了解v-atpase如何参与自噬。其研究结果也将为探讨v-atpase与细胞自噬之间的相互关系提供实验依据。通过探究v-atpase亚基缺失对细胞自噬的影响，确立v-atpase亚基是否及如何参与细胞自噬。
2、国内外研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标：
通过探究v-atpase亚基缺失对细胞自噬的影响，确立v-atpase亚基是否及如何参与细胞自噬。
2、研究内容：
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
研究方法主要包括基因敲除（Gene deletion），荧光蛋白标记技术（Fluorescent protein tagging technique）。
（1）基因敲除
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。本实验中通过基因敲除，用于获取系列突变体。
（2）荧光蛋白标记技术
利用DNA重组技术，将目的基因与荧光蛋白基因构成融合基因，整合到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。本实验中通过荧光蛋白标记技术定位Atg8和Pep4。
3、实验方案
（1）验证系列突变体stv1Δvph1Δ中会产生自噬受阻
A.以YHY9948（SEY6210 GFP-Atg8 Pep4-mCherry）作为出发菌株，通过基因敲除获取系列突变体stv1Δ，vph1Δ，stv1Δvph1Δ
B.普通荧光显微镜观察WT，stv1Δ，vph1Δ，stv1Δvph1Δ中GFP-Atg8的定位（即为自噬体的定位）以及液泡内水解酶Pep4的定位与表达。
（2）探究V-ATPase亚基Stv1和Vph1是否与液泡内水解酶活性的维持存在联系
A.以YHY9948及其突变株系stv1Δ，vph1Δ，stv1Δvph1Δ作为出发菌株，获得突变体pep4Δ，vps21Δ，pep4Δvps21Δ，stv1Δvps21Δ，vph1Δvps21Δ，stv1Δvph1Δvps21Δ
B.普通荧光显微镜观察WT，stv1Δ，vph1Δ，stv1Δvph1Δ，pep4Δ，vps21Δ，pep4Δvps21Δ，stv1Δvps21Δ，vph1Δvps21Δ，stv1Δvph1Δvps21Δ中GFP-Atg8与Pep4的定位与表达。
2.4可行性分析
本实验室以往的初步实验结果显示stv1Δvph1Δ会导致自噬体出现降解障碍，且可能与液泡水解酶活性有关，且本实验室对所需用到实验技术非常熟悉，本项目具备可行性。4. 研究创新点
目前研究发现v-atpase是维持溶酶体（或液泡）、高尔基体、吞噬小泡等细胞器的酸性及稳定细胞质基质ph的重要结构，但其对自噬的作用研究较少。
包括关于v-atpase对自噬有何作用以及如何发挥作用均不明晰。
本实验将探究v-atpase的stv1与vph1在在细胞自噬中的功能，为研究v-atpase与细胞自噬之间的关系提供了进一步的证据。
5. 研究计划与进展
2020.03-2020.04
在家阅读相关文献，进一步熟悉课题和实验方法，设计实验。
2020.05
以yhy9948（sey6210 gfp-atg8 pep4-mcherry）作为出发菌株，通过基因敲除获突变体pep4Δ，stv1Δ，vph1Δ，stv1Δvph1Δ，vps21Δ，pep4Δvps21Δ，stv1Δvps21Δ，vph1Δvps21Δ，stv1Δvph1Δvps21Δ。
