1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、本课题的意义
atm是dna双链断裂(dna double-breaks,dsbs)修复信号传导途径中的最关键激酶，它在哺乳细胞中起始dna损伤修复的响应机制。atm涉及神经性疾病的发生机理，但目前这种疾病还没有有效的治疗手段，研究这种疾病中的关键蛋白atm成为了研究的重点。在酿酒酵母和裂殖酵母中，tel1是与atm高度同源的蛋白，本课题采用裂殖酵母，其在进化上更接近高等真核生物，因此对裂殖酵母中tel1的研究可以为atm的探索提供基础性的帮助。
2、国内外研究概况、应用前景
2. 研究的基本内容和问题
1、研究的目标、内容
目前对于atm/tel1的激活方式已做出一些研究，证实染色体的改变和一些关键蛋白（nbs1等）的参与调控atm/tel1的激活过程，但atm/tel1二聚体和单体之间变的过程，其构象的变化，以及最初的起始激活信号还不清楚，所以重构出tel1的结构，并解析出其不同功能状态下构象的动态改变将对这些问题的解决提供重要的依据和帮助，这也是本课题所希望完成的工作。由于tel1分子量大，它不适合用核磁共振实验或x射线晶体衍射实验来研究它的结构，加之tel1二聚体具有对称构象的特点适于电镜结构研究， 因此本课题通过不断优化纯化方法获得纯度和均一度较高的tel1样品，利用单颗粒冷冻电镜技术获得较高分辨率的tel1结构，此外本课题拟通过tel1与底物的相互作用，用电镜捕捉到tel1构象的改变，用纳米金颗粒标记技术定位tel1的底物结合口袋。
2、拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
在目标蛋白tel1的氨基端加入tap（cbp-tev-proteina）标签，通过盐析、亲和层析等方法进行tap-tel1蛋白质的初步纯化，电镜研究tel1的形态，并进行三维重构。另外，研究发现，tel1与ssa2氧化应激蛋白有共纯化现象，并且ssa2能够接到tel1二聚体的组装，用ssa2抗体标记与tel1共纯化的ssa2蛋白，电镜观察其介导的tel1二聚体的组装方式。
由于tel1的活性部位在蛋白质的羧基端，利用cbp抗体标记tel1-cbp的羧基酸，电镜观察用抗体标记的tel1-cbp与未标记的tel1-cbp，进行三维重构，比较抗体所在的位置，初步判断tel1激酶的活性中心。
4. 研究创新点
（1）能够得到体外纯化的浓度或均一度较高的tel1激酶与ccq1-6his重组蛋白，并且在体外模拟体内环境，再现体内tel1激酶催化底物过程，并且通过电镜技术与三维重构技术能够得到蛋白质-蛋白质复合物的三维结构，观察蛋白质构象并分析结合位点等；通过纳米金标记技术更能清晰地在电镜下看到标记蛋白所在的位置，在三维结构中找到相应的标记位置。
（2）低温电镜(cryo-em)技术因为可以直观地反映生物大分子机器在接近生理状态的结构，近几年成为了研究大分子复合体的重要工具，一方面，冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的，而且对于样品的分子量没有限制。因此，大大突破了x-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100kda）样品的限制。另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。本课题利用cyro-em就其在tel1的结构和活化机制方面进行研究。
（3）本课题利用单颗粒分析方法重构蛋白质的三维结构。这种方法是通过收集大量颗粒的二维投影来获得三维结构，是目前冷冻电镜的主要重构方法，广泛应用于解析生物大分子、病毒以及复合物的结构，其最高分辨率已接近准原子分辨率，能够看到部分氨基酸的侧链基团。
5. 研究计划与进展
2013年12月~1月：将pcold1-ccq1质粒转化至表达载体bl21中，用镍柱进行初步纯化，离子交换或分子筛进一步进行纯化，得到纯度较高的ccq1-6his重组蛋白；
2014年2月~3月：从cc5060菌种中纯化tap-tel1蛋白，并检测其激酶活性；将纯化的tel1进行grafix，同时与ccq1进行孵育，电镜观察，分析与底物的结合口袋；
2014年4月：分别用ssa2抗体和cbp抗体标记tel1，电镜观察，三维重构，分析tel1二聚体组装方式与tel1激酶的活性中心。
