1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
重金属对环境的污染会导致农业损失和健康危害，之前已经有许多关于铜、锌等元素对植物的胁迫的研究，而近年来，铬（chromium, cr）元素污染的治理逐渐受到人们的重视[1]。
铬是广泛存在于自然环境中的重金属污染物之一，有致癌作用。铬污染来自某些工业制造行业，如金属冶炼、制革等，它们的生产中会排放含铬废物。临近铬排放的地区，土壤贫瘠，无法生产[2]。价铬是动物需要的微量元素。但是，在植物中，六价铬还没有被发现有任何生物学作用。铬元素可能会影响植物从萌发到生长发育的多个生理过程，抑制植物的萌发，降低植物生物量，代谢过程异常，甚至致死[3]。有研究表明，cr毒害是由于cr胁迫诱导了活性氧（ros）如超氧阴离子和或氧化氢的产生而引起的，它具有较高的毒性，可以氧化生物大分子物质如蛋白质、脂质等，并由此导致膜脂过氧化、细胞膜损伤和酶失活等[4,5]。探究铬对植物的胁迫和植物的抗铬胁迫机制，可以帮助我们提高植物的抗胁迫能力[6]，寻找具有更强抗逆性的品种，利用相关植物来进行土壤或者水体净化，降低环境中的有毒铬离子含量。因此，此方面的研究具有明显的现实意义。
2. 研究的基本内容和问题
目标：
探究氢气分子对cr诱导苜蓿的生长胁迫的缓解作用和可能的机制。
内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
对苜蓿种子进行表面消毒，用无菌水冲洗，用Hoagland营养液培养在培养箱中培养，120 mmol m-2 s-1光照，光周期为16/8（25/23℃）光期/暗期。每日更换新鲜培养液。为测定富氢水是否减轻Cr诱导的生长抑制，用25%的H2饱和溶液对Hoagland营养液进行前处理12 h，然后用浓度梯度的Cr对根进行处理，根据根长确定合适 的胁迫浓度。根据确定的金属离子浓度，先进行氢处理12 h，再进行金属离子处理24 h,未进行重金属处理的苗作为对照（Con）。Cr处理24 h后，通过测量TBARS来计量幼苗中TBARS依赖的膜脂过氧化。通过NBT、schifft、溴酚蓝染色检测O2-自由基、氧化产物、死细胞含量。通过分光光度法测量根中POD、CAT、APX、SOD活性，蛋白质浓度则依据Bradfor牛血清白蛋白法来确定。通过电感耦合等离子体原子发射光谱法测定根中Cr、Na、K、Ca离子含量。Cr处理72 h后，测量了干鲜重来判断富氢水是否缓解Cr处理对苜蓿生长量的影响。
技术路线：
目的：探究富氢水缓解苜蓿幼苗所受重金属胁迫过程中抗氧化系统及表型的变化 |
根据文献经验，用25%的氢饱和溶液对5日龄幼苗根部处理12 h |
用浓度梯度0，10，25，50，100 μM的 K2Cr2O7处理24 h后拍照测量根长，以其根长生长长度为对照的1/2为标准，确定最佳重金属浓度 |
用25%的氢饱和溶液对5日龄幼苗根部处理12 h，再用确定浓度的Cr处理24 h |
通过测量TBARS来计量幼苗中的膜脂过氧化 |
通过NBT、 schifft、evans blue染色检测O2-自由基、过氧化、质膜透性 |
利用分光光度计测量根中POD、CAT、APX、SOD活性 |
通过电感耦合等离子体原子发射光谱法测定根中Cr、Na、K、Ca含量 |
Cr处理72 h后，测量鲜重；烘箱中烘干3天后测量干重，从而得到失水比 |
通过干鲜重、根长、MDA等表型，以及相关离子含量，抗氧化酶活性以及细胞内自由基含量等差异，了解富氢水处理在何种程度缓解重金属离子对植物伤害及其原理 |
实验方案：
1、TBARS法测量膜脂过氧化
取0.24 g根，加入2.4 ml 10% TCA研磨，加入2.4 ml 0.67% TBA混匀后沸水煮30 min。8000 g离心10 min取上清液，用分光光度计测定A532，A600的光度值，计算出膜脂过氧化。
2、POD活性测量
用PBS（50 mM, pH=7.0）2.6 ml，愈创木酚（100 mM）300 μl, H2O2 (10%) 50 μl,与酶液50 μl迅速混匀，用分光光度计测定A470的光度值，计算得到POD活性。
3、CAT活性测量
H2O2(0.3%) 1 ml，H2O 1.75 ml 与酶液250 μl迅速混匀，用分光光度计测定A240的光度值，计算得到CAT活性。
4、APX活性测量
PBS（50 mM, pH=7.0）2.52 ml ，抗环血酸（2.5 mM）300 μl，H2O2(1%) 30 μl与酶液150 μl迅速混匀，用分光光度计测定A290的光度值，计算得到APX活性。
5、SOD活性测量
将2.8 mlA（含有PBS（50 mM, pH=7.8）200 ml，甲硫氨酸0.432g，乙二胺四乙酸（EDTA） 0.006g），1 mlB（2 μM核黄素），1 mlC（75 mM NBT）与150 μl酶样混合，在光照箱中反应4.5 min后用分光光度计测定A560的光度值，计算得到SOD活性。其中将不加酶样品避光作为空白对照，不加酶样品照光作为max。
6、离子浓度
将苜蓿根用剪刀充分剪碎至粉末状，精确称量与2 ml浓HNO3混合，利用微波消解仪消解后，用水定容至25 ml。利用等离子体发射光谱仪（Optima 2100DV，珀金埃尔默，美国）对Cr,Na,K,Ca离子含量进行测量。
7、染色
配置NBT，schifft，溴酚蓝染液，将苜蓿幼苗根浸于染液中30 s-1min，取出后在清水中漂洗3遍，迅速在体视显微镜下观察拍照。
8、根长
对5日龄的幼苗根部用梯度浓度为0，10，25，50，100 μM的 K2Cr2O7处理24小时后拍照。用ImageJ软件进行处理测量根长，找到最适重金属处理浓度。
9、干鲜重
选取根长一致的幼苗迅速吸干根部水之后称量鲜重，然后放置烘箱中55℃3天，称量干重，计算出失水比。
可行性分析：
1、实验原料易得。外源富氢水为研究植物体内氢气的特定生理功能提供了一个有力的研究工具。因为实验室有制备氢溶液的仪器，且此项技术较成熟，可以轻松安全地制备氢溶液。
2、理论基础成熟。前人研究中关于植物逆境胁迫以及富氢水缓解氧化还原伤害有较多报道。实验方案中所用的实验方法，如TBARS等方法都比较成熟，抑郁操作。
3、实验仪器完备。实验室有所需的实验材料和药品试剂，生命科学实验中心有测量所需的大型仪器如微波消解仪，体视显微镜，使实验设计可以进行。
整体来看，实验方案非常切实可行。
4. 研究创新点
尽管有较多关于植物重金属胁迫的文章和研究报告，但是关于铬元素对苜蓿根部的胁迫以及氢气分子对其胁迫的缓解作用和途径尚未探究清楚，值得研究。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展：
2014.02.15-2014.04.01 熟悉实验环境和基本操作流程，完成预实验。确定合适的氢溶液浓度和铬浓度。
2014.04.02-2014.04.30 完成膜脂过氧化，酶活测定和干鲜重测定。
