1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究意义
铝（Al）是地壳中最丰富的金属元素，约占总质量的7%。通常，土壤中的铝以无害的氧化物及硅酸盐的形式沉淀。然而，随着全球土壤酸化（PH5.5），土壤中的铝会以可溶性的三价铝离子（Al3 ）形式溶解出来，对植物产生毒害[4]。微摩尔级的铝离子即能够对植物产生毒害，包括快速抑制植物根的伸长，影响植物对水分和营养物质的吸收，直接影响作物产量[1]。
荞麦是一种高抗和高积累铝的植物，主要通过草酸的分泌来解铝毒，在叶片中积累的铝也是以铝-草酸盐的螯合物存在[2]。由于草酸在木质部中更易与钙离子形成络合物，因而铝在木质部的运输是以铝-柠檬酸盐螯合物的形态来进行的。然而，在荞麦中介导铝在木质部中转运的基因仍未被克隆[5]。本实验旨在克隆和解析荞麦中转运柠檬酸的两个MATE基因，阐明它们在铝转运过程中的重要作用，推进人们对荞麦高积累铝分子机制的认识。实验室通过RNA-seq已经获得了荞麦中可能参与解铝毒的相关基因序列，根据这个信息设计实验克隆基因，研究其功能，有利于阐明荞麦高耐铝和高积累铝的机制。
研究概况
自然界中有部分植物进化出抗铝毒机制，根据其发挥作用的部位不同，一般分为两种机制：外部排除机制和内部耐受机制[1]。外部排除机制主要是植物向外分泌有机酸（主要是苹果酸，草酸和柠檬酸）来螯合铝离子，将游离的铝离子转化为无毒害的铝-有机酸盐螯合物。内部耐受机制则是将已经进入植物体内的铝离子进行螯合，转移，区室化，避免铝离子与敏感的部位接触而进行解铝毒。许多参与解铝毒的基因已经被克隆出来，ALMT1家族参与植物苹果酸的转运，MATE家族的部分成员则与柠檬酸的转运有关，STOP1和ART1分别是拟南芥和水稻中的参与解铝毒的转录因子，OsALS1则与铝螯合物的区室化有关。虽然人们对铝毒机制有了一定的了解，但许多解铝毒的详细机制尚未了解透彻。
1外部解铝机制ALMT和MATE蛋白参与的有机酸分泌
外部解铝毒机制主要与多种有机酸例如柠檬酸，草酸，苹果酸的分泌有关。这些从植物根部分泌出来的有机酸能够与土壤溶液中的铝离子以一定的比例螯合，形成稳定无毒害的铝-有机酸螯合物，从而使植物的根部免受铝离子的毒害。荞麦主要从根部分泌大量草酸来螯合铝从而完成外部解铝毒。
MATE(multi-drug and toxic compound extrusion)家族最早在原核生物中发现，与有毒物质的解毒相关，在植物中则发现与柠檬酸的分泌相关[9]。它首先在高粱和大麦中发现，该家族的FRD3、OsFRDL1等在植物根中控制向木质部分泌柠檬酸，参与铁向地上部分的运输[6]。要研究的两个MATE基因中的一个属于FRD3,可能参与铝从根部向地上部的转运有关。而从小麦中分离出来的TaALMT1是第一个从植物中克隆出来的抗铝毒基因。ALMT(Aluminum-activated malate transportor)是与苹果酸分泌有关的基因家族，拟南芥，小麦的外部解铝毒机制都与ALMT1基因相关[3]。
2内部解铝机制 植物的内部耐受机制是当铝进入植物体后进行的，共质体的环境近中性，此时大部分铝离子将被沉淀，Al3 的浓度只有约10-10，然而即使的这样低浓度的铝也能对植物产生毒害。荞麦中根系吸收的Al3 能与根系细胞内的草酸螯合形成一种铝与草酸摩尔比1:3 的稳定的、无毒性的螯合物，再以螯合物的形式转运至对铝较不敏感的地上部。在转运过程中，由于草酸更易于木质部中的钙离子形成沉淀，因而在铝从根系转运到地上部分的过程中，铝与草酸络合物会转换成摩尔比为1:1 的铝柠檬酸络合物。当铝从木质部卸载到叶片中后，铝柠檬酸络合物又转换成了铝草酸络合物[4]。铝的亚细胞定位发现，叶片中的铝超过80%存在于原生质体通过27Al-NMR 研究鉴定为摩尔比为1：3 的铝草酸盐络合物，而原生质体中的草酸和铝绝大部分存在于液泡中，从而进一步明确荞麦叶片内部解铝毒是通过与草酸形成络合物和液泡的区室化[7]。尽管如此，目前我们对铝草酸络合物是如何经由细胞质进入液泡的过程还知之甚少。对于荞麦耐铝机制的深入了解给我们研究植物耐铝机理以及获得耐铝基因提供了很好的研究材料。 参考文献 [1] Zheng S J, Ma J F, Matsumoto H. High aluminum resistance in buckwheat I. Al-induced specific secretion of oxalic acid from root tips. Plant Physiology, 1998, 117(3): 745-751. [2] Ma J F, Hiradate S, Matsumoto H. High aluminum resistance in buckwheat II. Oxalic acid detoxifies aluminum internally. Plant Physiology, 1998, 117(3): 753-759. [3] Hoekenga O A, Maron L G, Pieros M A, et al. AtALMT1, which encodes a malate transporter, is identified as one of several genes critical for aluminum tolerance in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103(25): 9738-9743. |
[4] Ma J F, Ryan P R, Delhaize E. Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids. Trends in plant science, 2001, 6(6): 273-278. [5] Shen R, Iwashita T, Ma J F. Form of Al changes with Al concentration in leaves of buckwheat[J]. Journal of experimental botany, 2004, 55(394): 131-136. [6] Liu J, Magalhaes J V, Shaff J, et al. Aluminum‐activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance. The Plant Journal, 2009, 57(3): 389-399. [7] Zheng S J, Yang J L, He Y F, et al. Immobilization of aluminum with phosphorus in roots is associated with high aluminum resistance in buckwheat. Plant Physiology, 2005, 138(1): 297-303. [8] Delhaize, E., Ma, J.F. and Ryan, P.R. (2012) Transcriptional regulation of aluminium tolerance genes. Trends in Plant Science.950,18. [9] 李交昆, 唐璐璐. 植物抗铝分子机制研究进展. 生命科学, 2013, 25(6). |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
1克隆荞麦mate基因家族中frd3亚家族的两个基因，并对其进行mrna表达分析，亚细胞定位，体外功能验证等研究。
2阐明这两个mate基因在荞麦解铝毒和转运过程中的作用。
3. 研究的方法与方案
研究方法
1通过race的方法获得两个mate基因的全长并测序，获得其全长序列
2功能研究：
4. 研究创新点
特色或创新之处
荞麦是一个高抗和高积累铝植物，它主要通过分泌草酸来解除铝毒，同时草酸在荞麦吸收、转运和隔离铝的过程中也扮演重要角色，但是铝在从根向地上部转移过程中的木质部中主要与柠檬酸螯合进行运输。然而，荞麦中负责转运柠檬酸到木质部的基因还没有鉴定出来。本研究旨在克隆和解析荞麦中转运柠檬酸的两个MATE基因，阐明它们在铝转运过程中的重要作用，推进人们对荞麦高积累铝分子机制的认识。5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2013年10月：开始荞麦的水培工作，同时用race扩增两个mate基因。
2013年10月-2014年5月： 用多种方法研究基因的各方面功能。
