1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
镉(Cd)是对人和动植物毒性最大的重金属元素之一,随着工农业的发展,工业三废排放、矿产开采、电池乱扔以及农药、化肥的大量使用,导致部分土壤和水体的镉含量剧增。水稻种植于这种环境中,不仅生长发育受影响,产量品质下降,而且谷粒中会富集大量的镉,人长期食用这种镉稻会面临慢性中毒的风险。２０世纪５０年代日本暴发的骨痛病,就是由于长期食用在高镉土壤中所生产出的稻谷所致。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球有近一半人口(包括几乎整个东亚和东南亚)以稻米为主食,但正因为如此,它也成为人类最大的镉吸收源。为了消除或减少镉危害,培育低镉水稻品种是经济且有效的途径。因此,有关水稻镉胁迫应答分子机制的研究越来越受到生物学家的重视。
国内外研究概况：
在长期的栽培驯化过程中,水稻也进化出了多种抵御Cd２＋ 毒害的机制.首先,细胞壁是保护细胞原生质体不受重金属毒害的第一道屏障,耐镉品种能将大部分Cd２＋ 吸附在根部细胞壁上,减少Cd２＋向地上部的转运,从而减少Cd２＋ 对细胞的毒害,这在短时间内和低浓度下尤为重要；其次,原生质体中的大量非蛋白羟基分子,如谷胱甘肽(glutathione,GSH),在谷胱甘肽S转移酶(glutathione Stransferase,GST)的催化作用下,能与Cd２＋ 发生螯合作用,使其失活；第三,多种跨膜转运蛋白配合,能将大量游离态或螯合态的Cd２＋ 隔离进液泡,或排出胞外；最后,当Cd２＋ 胁迫造成伤害时,可能会激活作为分子伴侣的热激蛋白和抗氧化系统(如过氧化物酶),通过修复或降解受损蛋白、清除过量活性氧等方式减轻毒害.转录组和蛋白组比较分析也证实,镉胁迫下,GST、热激蛋白以及细胞色素P450等被强烈诱导。细胞壁(吸附)、巯基分子(螯合)、液泡(隔离)和转运蛋白(运输)等的参与,对限制Cd２＋ 的吸收和向地上部的转移发挥了重要作用。
P1B- ATP酶是一种跨膜的重金属离子泵,是P-ATP酶家族的一个亚族,它们利用ATP水解提供的能量来运输重金属离子通过细胞膜,对调节细胞内离子的平衡有重要作用。水稻基因组中至少有９个P1B- ATP酶,它们对不同的重金属离子亲和力不同,其中,OsHMA2和OsHMA3 被证明具有转运Cd２＋ 的能力。OsHMA3 编码P1B- ATP酶,主要在根部表达,过表达后能选择性降低Cd２＋ 在谷粒中的积累,但对其他重金属离子不起作
用。OsHMA3定位在液泡膜上,具有将Cd２＋ 从胞质运进液泡从而隔离起来的功能。OsHMA2主要在水稻的根部和节表达,其转录本富集在维管束，定位于质膜，在锌和镉向木质部的装载中发挥作用,并参与其从地下部向地上部的转运。
天然抗性巨噬细胞蛋白家族(natural resistance-associated macrophage protein,NRAMP)是生物体中一类参与多种二价金属离子转运的蛋白,广泛存在于细菌和动植物体内.水稻基因组中有７个预测的OsNramp 基因,其中OsNramp1和OsNramp5主要在根部表达,OsNramp2主要在叶中表达,而OsNramp3 在根和叶中都有表达,且OsNramp1和OsNramp5 的生物学功能已被验证。
OsNramp1主要在根部表达,其表达量高低与品种富集Cd２＋ 的能力相关,它的过表达会增加Cd２＋ 在稻叶中的积累。其定位在质膜上,参与了水稻对Fe２＋ 和Cd２＋ 的吸收和运输。OsNramp5限定在根的表皮、外皮层、皮层外层以及木质部周边组织表达,其编码蛋白极性定位在细胞的外侧质膜上。OsNramp5有助于Mn２＋ 、Fe２＋ 和Cd２＋ 的吸收和运输,对水稻植株的生长发育有重要作用。
上述提及的都是在镉的转运中重要的基因，除之以外，阳离子扩散促进因子蛋白、ATP结合框转运蛋白和低亲和性阳离子转运蛋白(lowaffinity cation transporter,LCT)等其他蛋白都参与镉的相关运输。
应用前景：
工业发展给耕地带来日益严重的重金属污染,粮食安全也因此遭受严峻挑战。为了消除镉、铅等重金属超标的有毒大米生产,降低或杜绝工业三废的随意排放是根本措施,但这一点在目前显然还无法做到.也有研究发现,通过优化水肥管理措施,可有效降低稻米中镉含量,如增施磷肥和硅肥、适量施用氮肥或者全生育期淹水等都能够缓解镉对水稻的毒害,但是,这势必会大幅度增加种植成本。因此,从遗传上改良水稻品种的耐镉性,选育大米镉积累量低的品种,成为减少稻米镉污染的一个经济且有效的途径。
现有的研究,也确实获得了一些低镉突变体材料,如日本冈山大学获得的OsNramp5 材料,籽粒中镉含量只有野生型的10％,但由于该突变体除了不吸收Cd２＋ 外,对其他微量元素如Mn２＋ 的吸收也大大降低,导致稻谷产量只有野生型的２０％,因此,该突变体还不能直接用于育种。另一些突变材料,如OsHMA2过表达株系、OsLCT1 敲除株系,它们虽不能像突变体OsNramp5一样几乎不吸收镉,但能特异地降低谷粒中的镉含量而不影响其他微量元素的吸收,这对培育低镉但不影响植株生长的水稻新品种很有意义.当然,如果能通过基因聚合手段,选育一些营养器官镉积累量高但稻谷镉积累低的品种,不仅能解决粮食安全问题,而且还能一定程度上消除土壤中的镉污染。
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2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
1) 获得中嘉早17的耐镉突变株，克隆相关基因并分析基因的相关功能。
2) 获得基因突变的低镉水稻品种，并应用与生产实践中。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1) 获得水稻的osnramp5超表达的转基因株系：基因工程技术，农杆菌转化法
2) 获得中嘉早17的突变体：ems诱变法
4. 研究创新点
特色或创新之处：
本实验的特色在于筛选突变体是利用根长的生长量来判断，这种方法很新颖也比较快捷。相对于已知报道的根据具体的镉含量指标等而言，在初筛突变体时节约很大的精力和资源等。进一步而言，在做生理数据时我们采用的icp-ms法来测量器吸收镉含量时，由于仪器的灵敏度很高我们能够更加精确的来得到突变株与野生型之间的差异值。
之后做基因定位分析时，mapping、qpcr测定表达量和gfp亚细胞定位等手段都是利用了国际通过的一系列分析的方法手段，使得整个实验的可行度和可参考意义更加大了。除此以外，水稻这种模式植物上相关重金属基因转运的研究可以应用到我们的生产中去，其实际的意义更大，会对我们的污染土壤修复和镉大米等问题的解决垫下良好的基础。
5. 研究计划与进展
2013/6 10%的ems诱变处理中嘉早水稻种子
2013/7-2013/11 水稻生长成熟并收获f1代
2013/12-2014/5 筛选耐镉突变株，得到突变材料并去海南繁种得到f2代，获得相关基因序列，克隆基因，研究作用机制
