不同信号肽对枯草芽孢杆菌分泌脂肪氧合酶的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义

脂肪氧合酶（lipoxygenase）属于氧化还原酶类，可以催化多不饱和脂肪酸。脂肪氧合酶在植物特别是大豆中含量丰富，与植物的生长发育、衰老有关，可影响自由基的产生和乙烯的合成。另外脂肪氧合酶在食品工业中也有广泛地应用。可用于大豆的脱腥、面粉的漂白、强化面筋，还可以显著改善食品的颜色、风味和营养^[1]。

脂肪氧合酶目前已经实现了在大肠杆菌中的表达和分泌，但是大肠杆菌不是公认安全的微生物，利用大肠杆菌生产脂肪氧合酶，应用于食品上存在一定的风险。枯草芽孢杆菌是公认的食品级的微生物，应用在食品生产中已有悠久的历史^{[2, 3]}。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌具有很大的优势：公认安全的微生物，不产生热源性的脂多糖和致热、致敏性的蛋白质；基因组信息清楚，1997年其模式菌株168菌株的全基因组序列就已经测定完成^[4]；它能够将蛋白分泌到胞外，直接释放到培养基中，简化了产物的进一步分离和纯化；枯草芽孢杆菌已经广泛地用于酶制剂的发生产，发酵技术成熟^[4-6]在实验室的前期工作中^[7]，已经成功的将来自于鱼腥藻pcc7120的脂肪氧合酶基因转入到枯草芽孢杆菌wb800中，并且在胞内得到成功的表达。但是重组的脂肪氧合酶不能分泌到胞外，丧失了枯草芽孢杆菌的巨大优势。本实验的研究内容就是通过在脂肪氧合酶前端添加不同的信号肽，引导脂肪氧合酶分泌到胞外，简化分离纯化步骤，为大规模发酵生产提供理论依据。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

研究不同类型的信号肽对枯草芽孢杆菌分泌脂肪氧合酶的影响，分析影响分泌量的因素，寻找引导脂肪氧合酶的最佳信号肽，实现脂肪氧合酶的胞外表达。

研究内容：

通过查阅文献和数据分析，可知枯草芽孢杆菌中带有信号肽的蛋白可以分为几种类型。根据功能划分为碳代谢相关蛋白、蛋白代谢相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、脂质代谢相关蛋白、磷酸盐代谢相关蛋白、细胞壁代谢相关蛋白、转运/结合蛋白和脂蛋白、孢子形成相关蛋白、RNA合成/调控相关蛋白以及未知功能的蛋白。还可以根据N端所带正电荷量划分，带电量从 1到 10不等，不同蛋白的信号肽带电量不同。

所以依据上述内容，我从代谢类型、N端带电量、蛋白分子量大小、信号肽长度等方面考虑，选出11种信号肽，研究它们是否能够引导脂肪氧合酶分泌到胞外。

采用重叠延伸PCR（SOE-PCR）的方法，将来自枯草芽孢杆菌的信号肽基因和来自鱼腥藻的脂肪氧合酶基因结合在一起。再将重组的基因用BamHI酶切后，连接到质粒上，转化到枯草芽孢杆菌WB800中，实现脂肪氧合酶在枯草芽孢杆菌中的分泌。

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采用Soe-PCR（重叠PCR）的方法，将信号肽和脂肪氧合酶基因拼接在一起，两端有BamHI的酶切位点，酶切后重组进质粒p BT23a。

设计两组引物A、B和C、D。A、D为正常引物，末端有BamHI的酶切位点；B、C为重叠引物，可以互补，进行重叠延伸PCR。

第一轮PCR 利用引物A、B扩增信号肽基因，利用C、D扩增脂肪氧合酶基因。

第二轮PCR 利用引物A、D扩增 SP和LOX结合的基因。

拟解决的关键问题

1、枯草芽孢杆菌的转化。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁较革兰氏阴性菌厚，不能像大肠杆菌一样利用CaCl2处理得到感受态，芽孢杆菌感受态的制备并不容易，一般采用饥饿法或电转法，但是无论采用何种方法，转化的效率都不高，甚至根本无法得到重组子。

2、外源蛋白在芽孢杆菌中的分泌。虽然芽孢杆菌有出色的分泌能力，可以分泌多种的蛋白，但是除了同源性较高的外源蛋白可以在芽孢杆菌中分泌较多外，其余的外源蛋白很难在芽孢杆菌中分泌，有些根本无法表达。

在本实验中，我将采取在外源蛋白前端添加信号肽的方法，引导外源蛋白分泌。是否可行还需要进一步的实验验证。

3. 研究的方法与方案

研究方法

1、菌体培养

鱼腥藻PCC7120基因组中脂肪氧合酶(ana-LOX)基因

枯草芽孢杆菌WB800 是宿主菌

枯草芽孢杆菌168菌株提供信号肽基因

鱼腥藻：BG-11培养基，28 ℃，130r/min，光照强度为 150uE.m-2 .s-1

大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌：LB培养基，37℃，180r/min，摇瓶培养。

2、DNA和质粒的提取

方法参照OMEGA公司的基因组提取试剂盒和质粒提取试剂盒的方法

3、引物设计与目的基因扩增

因为采用的是重叠颜色PCR的方法，所以引物设计时要考虑到重叠引物的设计。所有引物设计时尽量不要有发夹、颈环、二聚体等影响PCR效率和特异性的结构。该实验中所有引物都是通过Primer Premier 5 设计，并自动计算Tm值和GC含量。具体引物见下表。

4、重组质粒构建

本实验室前期工作中已经构建了重组质粒pBT-23a，它是以芽孢杆菌表达载体pHT43为骨架，删除该载体的Pgrac启动子和SamyQ信号肽序列，再将pET23a中的T7启动子重组到骨架中，构成含有T7启动子的枯草芽孢杆菌表达载体。

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重组质粒构建图

通过SOE-PCR的方法，将信号肽基因和脂肪氧合酶基因结合后，通过BamHI 酶切，质粒pBT23a也经过BamHI 酶切，用T4DNA连接酶将二者重组。

5、转化

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化采用改进的 Spizizen 法进行，详述如下

1、前一天晚上挑取宿主菌接种于 5 mL LB 液体培养基试管中，37oC 摇床培养过夜。

2、 第二天早上取 100 μL 过夜培养的菌液，接种至用 50 mL 离心管配置的 5 mL SPIMedium 中，37oC 摇床培养，3 h 后开始测 OD600，当培养物生长到对数末期时，快速取200 μL 接种到 2 mL SPII Medium 中，37oC 100 r/min 摇床培养 1.5 h。

3、加 20 μL 100EGTA 溶液，于 37oC 100 r/min 摇床培养 10 min，用 1.5 mL 离心管分装成 500 μL 每管。

4、 向管中加入适量的质粒，轻轻混匀于 37oC 100 r/min 摇床培养 30 min。

5、 将离心管转移到 250 r/min 摇床，37oC 养 1.5 h。6. 以 4000 r/min 离心收集菌体，弃部分上清液，留 100 μL 重悬菌体，涂布于相应的抗性平板，37oC 过夜培养。

6、筛选

通过相应的抗性平板进行筛选。

7、酶活测定

分光光度法：用亚油酸钠作为底物。酶反应体系中含有：pH 6.0 的磷酸缓冲液2.79 mL，酶液 10 μL，亚油酸钠 200 μL，混匀后放入 35 ℃水浴中并开始计时，反应 3 min 后测定吸光度。酶活单位定义：在上述条件下以1 min 内 3 mL 反应体系在 234 nm 的吸光度增加0.001 作为一个酶活力单位 U。

KI-淀粉法：取 0. 2 mL 酶液( 已用蒸馏水稀释 10 倍后的酶液) 于试管中， 加入 2 mL 底物乳状液( 0. 03 mol/ L亚油酸分散于含 10 uL / mL 吐温- 20 的水中，调 pH值至 9. 0) 并开始计时，于 30 ℃水浴中反应4 min后加入 0. 1 mL，1% 的可溶性淀粉、0. 4 mL 饱和 KI溶液( 新鲜配制) 和 5 mL 15% 的醋酸溶液。室温下显色并测定显色 8 min 时体系的吸光度，以 1 min内 3 mL 反应体系在 470 nm 的吸光度增加 0. 001作为一个酶活力单位U 。

技术路线图

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可行性分析

信号肽是蛋白分泌的引导序列，当蛋白穿过细胞膜后信号肽被信号肽酶（SPaseI/II）切割，不会影响成熟蛋白质的结构。所以通过添加来自于芽孢杆菌自身的信号肽不会影响外源蛋白的结构。国内外也有许多的文献证明可以通过改变信号肽实现外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌（具体见国内外研究现状）。在实验室的前期工作中，重组质粒和宿主菌都已经构建完成，并且实现了脂肪氧合酶在胞内的表达，只是不能分泌到胞外，我的工作就是在前人的基础上，实现脂肪氧合酶的分泌。

4. 研究创新点

关于应用型酶类的研究主要以大肠杆菌为宿主，因为大肠杆菌的感受态和转化很容易，但是大肠杆菌没有分泌功能，产物会积累在细胞内对细胞造成损害，影响产量，并且需要将细胞壁破碎后才能提取到产物。

对于转化枯草芽孢杆菌的研究，目前主要以理论研究为主，以不折叠蛋白或绿色荧光蛋白为报告蛋白，还没有文献记载脂肪氧合酶能够在枯草芽孢杆菌中分泌，该实验首次进行方面的尝试，为脂肪氧合酶的大规模发酵生产提供理论基础。

5. 研究计划与进展

2013.11-2013.12 查找文献，确定研究方向

2014.1-2014.2 阅度文献，确定研究课题，设计研究方法。

2014.3 基因组dna的提取及信号肽、脂肪氧合酶基因的扩增