复合性复合性状转基因水稻T1c-19向其非转基因亲本及杂草稻基因漂移的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

我国是世界最大的水稻生产国和消费国，水稻在我国粮食生产中占有举足轻重的地位。目前已经培育出了大量抗虫、抗病、抗除草剂以及具有其他优良品质性状的转基因水稻，甚至复合性状的转基因水稻^[1-3]。转基因水稻的种植在带来经济和社会效益的同时,也存在一定的风险，其中重要风险之一是抗性基因通过花粉漂移到杂草上，导致抗性杂草的产生，增加防除的困难。

在水稻的近缘杂草中，最值得关注的是杂草稻。杂草稻(weedy rice或red rice, oryza sativa f. spontanea ，aa，2n=24)与栽培水稻（oryza sativa l.）同属于稻属稻种，在世界各地大多数水稻种植区均有发生^[4-6]。杂草稻与栽培水稻竞争阳光、水分和养分，从而降低水稻的品质和产量,杂草稻具有极强的杂草性状，如强落粒性、休眠性及抗逆性，使得种子能逃脱收获，进入土壤种子库，不断繁衍滋生。另外杂草稻与栽培水稻在形态结构和生理生化代谢等方面的相似性，使得它和栽培水稻对除草剂的反应一致，因此尚无有效的除草剂对其进行有效防治^[7]。因而目前已成为限制拉丁美洲、东南亚国家水稻产量提高的最主要的杂草因素^[8-9]。50-60年代，我国安徽省巢湖、江苏连云港、海南、广东等部分稻区就报道有杂草稻发生，随着管理水平的提高，70年代后期已很少发生。但近年来随着水稻轻型栽培技术的发展，特别是免、少耕技术的推广应用，造成了有利于杂草稻萌发生长的农田生态环境，导致杂草稻在我国水稻田的危害逐年加重，特别是在黑龙江、辽宁、江苏、广东、海南等省份^[10-11]，给水稻生产带来的损失越来越大。到目前为止，针对杂草稻并没有简单有效地的防控措施。种植抗除草剂转基因水稻是防治杂草稻的有效措施，但是抗性基因向杂草稻的漂移所带来的潜在生态风险却不容忽视。

转基因水稻和杂草稻能发生初始杂交这一事实已经得到大量研究工作的证实^[4，12-17]。外源抗性基因漂移到杂草稻后，有可能产生携带抗性基因的杂交后代，这将使得杂草稻的防控工作变得更加困难，并可能危及转基因技术本身^[14]。花粉介导的转基因水稻向杂草稻的基因漂移受许多生物因素和非生物因素的影响。转基因水稻和杂草稻的亲和性是基因漂移发生的生物学基础^[17]，虽然栽培水稻与杂草稻属于相同物种，并没有生殖隔离，但栽培稻与杂草稻之间以及杂草稻内部仍存在生理和遗传上的差异^[10]。同时，田间自然情况下的异交率，还与花期重叠的时间长短、植株的高度差异等密切相关^[12]。因此不同转基因水稻向不同杂草稻发生基因漂移的可能性不完全相同。转基因水稻向非转基因水稻和杂草稻的基因漂移已有很多报道，不同研究者由于采用的试验材料、种植方式不同，各研究报道中的基因漂移率也有明显的差异^{[12-13,15，18，19]}。常用的方法有同心圆种植、隔行种植和相邻种植等。如messeguer et al.和chun et al.采用同心圆种植方式^[20，21]，前者研究发现抗除草剂转基因水稻向栽培稻和杂草稻的最大基因漂移频率分别为0.106%和0.063%；后者研究发现抗除草剂转基因水稻向杂草稻的最大基因漂移频率为0.024%，最大漂移距离为7m^[22]。戎俊等采用隔行种植的方式发现抗虫转基因水稻向其非转基因亲本的最大基因漂移频率为0.832%^[23]；rong et al.采用相邻种植方式发现供试转基因水稻向其邻近的非转基因亲本的最大基因漂移频率为0.79%^[24]。采用三种种植方式研究了抗草铵膦转基因水稻向栽培稻和杂草稻的基因漂移，结果显示最大基因漂移频率为0.302%^[12],zuo et al采用相邻种植的方式发现抗草铵膦除草剂向杂草稻的最大基因漂移为0.666%。目前的报道中除向雄性不育系的基因漂移率较高外，大多数的研究表明从转基因水稻向非转基因水稻和杂草稻的基因漂移率低于1%，并且同一材料在顺风方向大、逆风方向基因漂流频率小，且随着距离的增加，基因漂移频率明显下降^[13][23-28]。以上3种试验设计各有其优缺点，同心圆种植所需的试验地面积大、收获的花粉受体材料量较大，花费较多的人力、物力和时间，同时也不能反应田间的真实环境；隔行种植保证了杂草稻与转基因水稻的接触机会，相比同心圆种植更适合检测最大基因漂移频率；相邻种植最能反应田间杂草稻与水稻的伴生环境，相比同心圆种植，能在小范围的试验中获得最大的基因漂移风险。因此选择合适的种植方式，才能正确估计转基因水稻向杂草稻的基因漂移，充分揭示其风险水平。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

1、获得复合性状转基因水稻向受体水稻的基因漂移率；

2、获得复合性状转基因水稻向茂名、泰州、益阳杂草稻的基因漂移率。

3. 研究的方法与方案

试验材料

复合性状转基因水稻T1c-19，携带人工合成的抗虫基因cry1C*和抗除草剂基因bar，采用共转化的方法将两种基因紧密连接之后通过农杆菌介导转入水稻明恢63（MH63）中获得。该转基因水稻和受体水稻明恢63（MH63）均由华中农业大学提供。选用三种杂草稻茂名杂草稻（WRMM）、泰州杂草稻

（WRTZ）、益阳杂草稻(WRYY)分别由本实验室人员在广东茂名、江苏泰州、湖南益阳采集。试验材料的基本特性见表1。

表1 试验材料的来源和基本特性

技术路线

试验方案

水稻种植都在南京农业大学江浦试验农场（N32.011569, E118.624535）杂草研究室的转基因作物安全性评估试验基地进行。该试验基地获得农业部批准。2014年5月28号育秧，30 d后选择大小一致的水稻秧苗移栽进大田，一株一穴。试验设计隔行种植和相邻种植两种种植方式。水稻整个生长期按照常规稻田的标准进行水肥和病虫害管理。水稻成熟后按批次和种类分别收获，晒干后低温保存，田间转基因水稻收获后烧毁。

隔行种植：

转基因水稻T1c-19和其受体水稻MH63、杂草稻隔行种植。

种植方式见示意图1。每处理小区的面积为5 m3 m，，每处理重复4次，小区间隔60cm。移栽行的方向与当地盛行风向垂直，以保证行间最大可能的花粉漂移。

图1.隔行种植示意图（表示转基因水稻，●表示受体水稻或杂草稻）。

相邻种植

转基因水稻T1c-19和三种杂草稻相邻种植。

为最大限度保证杂草稻与转基因水稻花期相遇，将杂草稻种植一批，转基因水稻种植4批，每批间隔7天。株距行距分别为20cm和30cm。小区间隔60cm。种植方式见示意图2。

图2.相邻种植示意图（黑色方块杂草稻、圆圈代表转基因水稻，其中的数字代表批次）。

取样方法及田间调查内容

a.株高的测定

在开花期随机测量30株转基因水稻和花粉受体材料的株高。

b.花期调查

在开花期间观察并记录转基因水稻和花粉受体材料的花期及花期持续时间，并统计转基因水稻和花粉受体材料花期重叠时间。

c.开花节律调查

每种花粉受体材料选取大小适中且穗子中部开花的10个穗子，从第一朵小花开始，每隔30min统计一次每穗新增加中开花数量，直至穗子当天开花结束。最后统计每个穗子总花数量（包括开过的和未未开的小花），计算每个时间段开花百分率。

d.抗性检测

对收获的杂草稻种子每个小区选出10000粒打破休眠（放入55℃烘箱5天），进行萌发率检测。测定收获的每种花粉受体种子的千粒重，每种受体材料重复4次。把装有100粒种子的培养皿放置于30℃光照培养箱培养7天，测定每种花粉受体材料的发芽率。参照Park et al.( 1996)、Escorial et al.（2001）和Song et al. (2011)的方法和我们的预备实验，将选取的待测花粉受体F1代和花粉受体亲本种子用70%的乙醇溶液消毒30s，然后浸泡在无菌水中15min，吸干水后再用无菌水反复冲洗种子5次。将待测的种子置于两层滤纸的周转箱中，用浓度为40 mg ai.L-1的草铵膦溶液浸泡，放在温室内培养10天后，测量胚芽鞘的长度。若胚芽鞘长度长于2cm，则认为该幼苗携带有抗性基因。抗性筛选工作在南京农业大学牌楼教学实验基地温室内进行。将筛选出来的幼苗移栽在育苗盘内培养至3叶期，采取叶片，进行分子检测。

cry1C*、bar基因扩增引物序列及扩增产物大小

PCR反应体系：

Mix 12.5μl，ddH₂O 9.5μl，引物P1、P2 各1μl，DNA1μl。

PCR反应程序：

94℃，变性5 min；94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10min。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段。

基因漂移频率计算

漂移频率=（抗性种子数/检测种子总数）100%

种子总数=种子总重量/千粒重1000发芽率

4. 研究创新点

目前关于转基因水稻的基因漂移的报道都是针对单一性状的，尚没有针对复合性状的基因漂移报道。由于复合性状的转基因作物转入了2个或2个以上外源基因，外源基因引起的转基因作物生存竞争能力的改变可能比单一性状的转基因作物更为复杂，因此对复合性状转基因作物的基因漂移风险更应该全面的评价。

5. 研究计划与进展

计划：

水稻种植在南京农业大学江浦试验农场（n32.011569, e118.624535）杂草研究室的转基因作物安全性评估试验基地进行。该试验基地获得农业部批准。

2014年5月-2014年6月：试验材料育秧，按照试验计划移栽；

2014年6月-2014年10月：种植试验材料后，按照试验计划进行观察和测量，包括花期、每日开花节律、株高等；