1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

低温作为一种重要的非生物性胁迫因素，影响着植物分布、产量及品质。其中的农作物低温冷害问题，更是给人类社会带来了巨大的经济损失，制约着农牧业的发展。研究低温对植物生理生化造成的影响，以及植物响应低温胁迫的分子机理，对改善作物耐寒性、提高经济作物产量和绿化环境有着重要的理论及实践意义。

目前国内外主要采用拟南芥作为材料来研究低温胁迫对植物的影响。拟南芥作为模式植物，其低温应答调控网络的研究较为充分，主要包括：aba依赖途径和aba非依赖途径。aba依赖途径的核心是bzip类转录因子对含有aba应答元件（abre）基因的调控。适当浓度的aba可增强植物的抗寒能力，其作用机制是aba信号在abres 的介导下启动植物抗寒基因（如cor等）的表达，从而增强其抵御低温逆境的能力。aba非依赖途径主要包括ice1和cbf（也称作dreb）等重要组分。其具体传导途径为：ice1转录因子→识别ice1盒→激活cbf转录因子→识别crt/dreb基序→cor基因表达→植物抗寒性增加。ice1为组成型表达、定位于细胞核中的bhlh类转录因子，受低温诱导，并能与cbf3启动子的myc顺式元件结合，驱动该基因的表达。有研究表明ice1表达的缺失会导致大约一半的cor基因无法被正常低温信号激活，其中大约三分之二为转录因子。并且相当一部分转录因子的启动子上具有ice1结合元件，这表明ice1是一个低温表达调控的关键因子。

目前国内外研究主要集中于低温胁迫对植物细胞膜体系、光合作用、抗氧化系统、植物激素的影响。其中，植物响应低温胁迫的信号通路及基因作用网络的研究是解析植物抗寒生理规律的基础和热点所在。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

目前大量研究表明,dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。dna甲基化转移酶是一种重要的调控基因表达、基因激活和基因关闭的机关。5-氮胞苷（5-azacytidine）作为一种去甲基化试剂能抑制该酶的活性，从而引起dna去甲基化或半去甲基化。

本课题拟使用模式植物拟南芥作为实验材料，利用5-氮胞苷（5-azacytidine）作为去甲基化试剂，来研究ice1基因去甲基化程度对拟南芥耐寒性机制的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法

通过5-氮胞苷（5-Azacytidine）处理，得到不同甲基化程度的拟南芥材料

测定不同甲基化程度拟南芥材料的耐寒性

利用qPCR测定不同甲基化程度的拟南芥材料中ICE1基因的表达情况

统计拟南芥的各类生理指标，找出其与甲基化程度的关系

实验方案

材料及处理

选用4类不同种群的拟南芥，分别用不同浓度5-azaC (0, 30, 100, and 500 μM)处理，并进行萌发培养。

耐寒性的测定

取拟南芥，测定其低温半致死温度来表征其耐寒性

相对表达量的测定

设计相应引物，通过qPCR测定不同甲基化程度的拟南芥材料中ICE1基因的表达情况

各类生理指标测定

开花时间（从温室实验算起到第一次出现白花瓣）；开花时莲座叶直径；最终植物高度；最终基部和侧枝分支情况；长角果数量；最终地上部分生物量（60度干燥24h）；低温半致死温度等指标。

技术路线

可行性分析

本项目实验方案中所涉及的各种技术和方法，均为成熟的分子生物学和植物生理学技术，包括qPCR、低温半致死温度测定等，课题所在的实验室已掌握，且大部分已经应用到研究工作中。

4. 研究创新点

研究耐寒基因DNA甲基化程度与拟南芥耐寒性的关系

截至2015年3月5日，检索NCBI PubMed文献数据库，以cold stress，plant, methylation为检索词，检索到25篇论文，只有一篇探讨曲古抑菌素选择性抑制冷诱导的ZmDREB1基因转录，其中部分涉及到玉米ICE1基因。以上检索结果结合立项依据中的文献信息可知，目前没有关于拟南芥ICE1基因去甲基化与调控耐寒性机制的研究。

因而，本项目的研究内容是新颖的。

5. 研究计划与进展

2014.10-2014．11选取不同种群的拟南芥进行种植，并在萌发阶段施以系列浓度的5-氮胞苷（5-azacytidine）。

2015.12-2015．2-在一定生长时期，选取不同种群拟南芥叶片，提取植物rna，反转录成cdna,并利用qpcr技术针对相关基因进行相对表达量分析。

2015.3-2015.4在植物生长周期中统计开花时间（从温室实验算起到第一次出现白花瓣）；开花时莲座叶直径；最终植物高度；最终基部和侧枝分支情况；长角果数量；最终地上部分生物量（60度干燥24h）；低温半致死温度等指标