1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
昆虫病原线虫与其细菌共生物互惠共生，其中嗜线虫致病杆菌属(xenhabdus) 与斯氏线虫(steinernema)共生、发光杆菌属(phothabdus)与异小杆线虫(heterhabditis)共生、嗜线虫沙雷氏菌（serratia nematodphila）和拟异小杆线虫（heterhabditidoides chongmingensis）共生[1-4]。相比于传统农药，昆虫病原线虫-共生菌复合体可以作为一种新型绿色农药来开发，其具有宿主范围广，对人畜无害，不污染环境，杀虫速度快且能以低成本大规模生产等优点，现已成为目前生物防治领域的热点。目前研究发现，昆虫病原线虫-共生菌复合体对大量隐蔽害虫和土壤害虫的防治方面取得显著成绩[5,6,7,8-10]，引起了产业界和科研部门的高度重视[7,23,24]。昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内，二者互惠共生。在这类生物防止因子中，线虫作为共生菌的传播媒介，对宿主昆虫起致病作用的是共生菌的代谢产物。这些代谢产物可以广泛应用于医药和农业，如抗细菌[11-19]、杀虫[14]、杀真菌[15]、杀线虫[19]、抑制肿瘤细胞生长[19-22]和抗病毒等。所以对昆虫病原线虫与共生菌之间的共生机制的研究，对于生物防治具有重要意义。它们之间的共生作用和致病作用分别由各自一系列的基因来调控。
microrna（mirna）是一类大小为20~25 nt左右的内源性的非编码小分子rna，其在基因的表达调控中有着重要的作用。mirna的作用方式主要是降解靶基因mrna或抑制靶基因mrna的翻译，即在转录水平或转录后水平调控基因的表达。mirna最早在秀丽隐杆线虫中被发现，其后在其他生物体内也有发现。目前已有相关研究发现，mirna参与线虫的细胞增殖、分化衰老、代谢以及发育等过程[23]。
dz0503sbs1t菌株是本实验室发现的沙雷氏菌属昆虫病原线虫共生菌模式菌株。拟异小杆昆虫病原线虫dz0503cmft的无菌卵在无菌培养基上离体培养为无菌侵染期幼虫，再各接入共生菌dz0503sbs1t培养。经实验发现共生菌dz0503sbs1t对线虫的恢复发育、后代产量、雌雄比及形态大小有一定的影响。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
利用荧光检测，从预测的候选靶基因中筛选并确定崇明拟异小杆线虫中n-mir-9的靶基因。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案
1.1 线虫学实验
1.1.1 线虫的繁殖
所有进行研究的线虫均用大蜡螟进行繁殖。在铺有2张湿滤纸的培养皿 (6015 mm) 里将15条大蜡螟暴露在大约2000条侵染期线虫的周围并放于20 3 ℃培养箱中保湿培养。雌雄同体线虫和第1代成体线虫各自通过解剖被侵染的大蜡螟收集。侵染期线虫在接种数天后从大蜡螟尸体中出现。
1.1.2 单菌线虫的培养
侵染期线虫感染大蜡螟数天后，从尸体内分离得到怀卵的大雌母线虫，用0.4M NaOH与2.5NaOCl充分摇动或旋转5分钟，确保杀死大雌母线虫，释放并消毒体内卵。将所得卵3000rpm离心1分钟，弃上清，再用无菌蒸馏水洗卵3-5次，将卵悬液滴入已经在肝-琼脂培养基上培养2d的分别含n-miR-9过表达载体的菌株和空载菌株的菌落上，25℃恒温培养。因而，构建的单菌线虫组合分别为：DZ 含n-miR-9过表达载体菌株；DZ 空载体菌株。
1.2 n-miR-9的靶基因的筛选
1.2.1 前期高通量测序分析
实验室前期已经DZ0503SBS1T共生菌线虫的 miRNA 的基因芯片进行了高通量测序分析，发现了一些新型的miRNA。
1.2.2 n-miR-9靶基因的预测
利用RNAhybrid和PicTar两种靶基因预测软件预测n-miR-9的靶基因，选择两者预测的靶基因的交集进行生物学验证分析。RNAhybrid是利用miRNA和靶基因二级结构来预测的软件，它根据miRNA和靶基因之间结合能探测最佳的位点，同时克服了其它二级结构预测软件的缺点，提高了预测速度。PicTar允许miRNA和靶基因的不完全互补，因而可以预测多个miRNA协同作用的靶基因。目前这两个软件尚未含崇明拟异小杆线虫miRNA的预测信息，我们以模式生物秀丽隐杆线虫为预测对象进行预测。
1.3 荧光定量验证崇明拟异小杆线虫中新型miRNA n-miR-9的靶基因
1.3.1 Trizol法提取线虫总RNA
1.3.1.1取无菌线虫直接放入研钵中，加入少量液氮后迅速研磨，使组织变软后再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
1.3.1.2 细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。12,000rpm 离心 5min，弃沉淀。
1.3.1.3 按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，剧烈振荡15s混匀后室温放置 15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组 DNA 断裂。4℃ 12,000g 离心 15min。
1.3.1.4 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取 DNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于 4℃冰箱,若只提 RNA，则弃下层酚相。
1.3.1.5按0.5ml 异丙醇/ml Trizol（与当前水相等体积）加入异丙醇混匀，室温放置 5-10min。4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。
1.3.1.6 按 1ml 75乙醇/ml Trizol 加入 75乙醇（DEPC水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀(洗涤时，一定弹起沉淀，上下缓缓颠倒6X，后离心5~10min，再重复此步骤后晾干)。4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。
1.3.1.7 室温晾干或真空干燥 5-10min。 注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。
1.3.1.8进行DNase 处理或者用50ul H2O，TE buffer或 0.5SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min（注：H2O、TE或 0.5SDS均须用DEPC处理并高灭菌）。
1.3.1.9 -80℃保存。
1.3.2总RNA琼脂糖凝胶电泳及质量检测
1.3.2.1 用洗洁精将制胶模具、梳子、电泳槽清洗，用蒸馏水冲洗干净后，将模具、梳子等放入电泳槽加 30双氧水，浸泡 30min；
1.3.2.2 倒掉双氧水，用 DEPC水冲洗电泳槽，用无水乙醇擦拭电泳仪器，晾干；
1.3.2.3 组装好制胶模具，封闭模具边缘，架好梳子，用 0.5TBE buffer 制作 1琼脂糖凝胶，凝胶冷却后拔出梳子，将凝胶置于加有 0.5TBEbuffer 的电泳槽中，缓冲液以浸没胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
1.3.2.4 在超净工作台上，用移液器吸取 RNA 样品 5.0μL与1μL 6Loading Buffer混匀后小心加入电泳槽中被浸没的凝胶加样孔内；
1.3.2.5 打开电源开关，调节电压至 120V，约15min后终止电泳 ( 根据样品Loading Buffer中指示剂的位置判断是否终止电泳)，将凝胶用EB染色放于凝胶成像仪上初步检测总 RNA的质量。
1.3.3 cDNA 合成
1.3.3.1将RNA模板和RNase-Free Water 溶解，5SuperQuick RT Master Mix，并置于冰上备用。
1.3.3.2根据以下表格配制反应体系，总体积为10μL（反应液配制请在冰上进行）。
表1
试剂 | 10μL反应体系 | 终浓度 |
RNA Template | X μL | 1pg~ 0.5μg |
5SuperQuick RT Master Mix(f Real-time PCR) | 2μL | 1 |
RNase-Free Water | up to 10μL |
1.3.3.3涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
1.3.3.4 37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
1.3.3.5逆转录产物可直接用于荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。
1.3.4 miRNA定量靶基因的扩增
1.3.4.1查询转录组数据，获得靶基因的序列。
1.3.4.2应用primer5.0进行引物设计靶基因定量引物。
1.3.4.3 用合成好的引物，以cDNA为模板进行PCR，扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.5 miRNA 靶基因实时荧光定量 PCR 检测
利用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo，日本）对线虫cDNA进行实时荧光定量PCR检测，每个cDNA样品设置3个重复。用ABI 7300 HT实时荧光定量PCR仪检测两种线虫中miRNA靶基因的表达量。
1.3.6 计算miRNA靶基因相对表达量
miRNA靶基因相对表达量的计算参照 Livak 等（2001）发明的基因表达量相对定量分析方法[21]，实验组相对于对照组 miRNA 的表达量变化用下列公式表示：2－△△Ct2(Ct 对照组 miRNA-Ct 对照组 18S-Ct 实验组 miRNA Ct 实验组 18S)
Ct 值由计算机根据扩增曲线自动分析得出，18S rDNA为内参。利用茎环引物实时荧光定量RT-PCR来验证芯片结果的可靠性，18S rDNA 作为内参，每个样本设置 3 个重复。miRNA 靶基因的扩增曲线呈S型且熔解曲线均在 85℃左右呈单一峰值，说明为特异性扩增，扩增效果良好。
可行性分析：
1.本课题指导教师多年从事动物学教学以及线虫的研究，对此有丰富的知识储备和实验经验，实验技术方法成熟，已发表多篇文章。实验室团队对次课题方向了解深入，技术熟练。
2.本课题依托南京农业大学生命科学学院动物学实验室，具备实施本课题所需的各种实验设备和实验技术方法，实验条件成熟。
3.申请者为生物基地121班同学，已完成了相关课程的理论学习，并参加过大学生科研训练（SRT），具备一定的科研素养和知识储备。
4. 研究创新点
1.本课题研究的miRNA为新型n-mir-9，目前尚未有对此有相关报道；
2.本实验利用荧光定量检测靶基因的表达量变化，初步确定n-mir-9的靶基因；再构建靶基因的过表达载体，进一步验证miRNA与靶基因的互作。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2015.10-2015.11 阅读文献，了解线虫和共生菌的相关知识；学习基础实验操作；
2015.12-2016.2昆虫病原线虫及共生菌的培养；
