古银杏土壤真菌分离与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义

随着银杏林产业的迅速发展，银杏叶、白果的产量迅速增加，药用银杏叶原料的市场趋于饱和，林产处于不增收的窘境中。银杏叶的深加工研究亟待拓宽。银杏叶的生物处理是一条有前景的深加工途径，但目前对银杏叶进行有效分解利用的微生物尚缺乏研究。本课题采集湖北安陆市古银杏树土壤菌群的多样性进行分析，考察银杏叶分解菌系的特点，以便为银杏叶的生物处理选择合适的菌株。另外，微生物是土壤的重要生物指标，在养分活化和迁移中有重要作用。土壤微生物多样性的研究可以间接反映土壤的理化性质。再者，微生物的丰富度及其变化能够体现其适应环境的过程。森林植被对土壤环境有一定的影响，进而影响到土壤微生物的群落结构和多样性，所以研究森林植被多样性和土壤微生物多样性之间的相互关系，对于反映林区土壤生态和微环境气候的变化等有积极作用。但是，自然界中可培养的微生物不到总数的l％。，这就给客观认识环境中微生物的存在状况造成严重障碍。分子生物学技术的发展为这一领域的研究提供了重要工具。

2. 国内外研究现状分析

由于国内外对于土壤这一特殊的生态环境的研究还很肤浅，国内的研究方法较为传统，大多采用培养法，迄今为止只有1%的微生物能够被培养，而大多数种类只能生存却无法培养，因此传统的研究方法埋没了大量的微生物资源，丢失了一些重要的微生物信息。 加之土壤微生物种类及数目庞大，个体体积小，可视性差以及对于土壤微生物在土壤中真正的生存环境认识还不够深入等，以上都成为我们获得土壤微生物种群结构信息的致命阻碍， 所以研究者大多孤立地研究微生物多样性的某个方面。所以，对土壤微生物分子多样性的研究，今后有必要加强不同方法的有机联系及其与传统研究方法的结合，并不断设计和探索出简单、准确地研究方法。 事实上，已有使用上述方法综合研究的一些报道，如厌氧菌培养条件的改进，荧光标记技术与16SrRNA基因序列多样性研究方法相结合，16SrRNA基因序列多样性研究方法与杂交技术的结合等，这些无疑会促进微生物多样性研究的深入。其多样性的研究将为阐明生态和生物进化原理提供新的模式，同时也将为许多新兴学科、交叉学科的发展开辟广阔的前景。

3. 研究的基本内容与计划

利用PCR技术先将土壤中的细菌DNA提纯并扩增，待胶完全凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的装置中，每个加样孔加入含有10%加样缓冲液的PCR25μL.在150Vde电压下，60电泳6.5个小时，电泳完毕后，将凝胶进行硝酸银染色。最后经过DGGE指纹图谱DNA条带分析，应用凝胶分析软件对扫描所得图谱进行条带识别和分析。

4. 研究创新点

DGGE技术作为一项新兴的研究手段和工具,还需要加强和改进以下几个方面: (1) 需要摸索适合具体样品的DNA 提取方法和最佳PCR条件;(2)优化DGGE条件和仔细分析具体结果。(3)加强DGGE技术与其它技术的联用。有研究中发现 ,同一种样品采用不同的方法分析,传统方法能够检测到的细菌,在分子方法中却不能被发现, 这可能是在PCR 过程中该菌未被扩增的缘故。DGGE 方法可以采用双梯度DGGE /TGGE, 如联合使用一个丙烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分辨率; 利用末端标记的荧光PCR产物、附加荧光内泳道标准化检测稀少群落组成和精确的样品对样品比较。使用功能型基因作为分子标记也能区别关系相近但生态差异的种群; DGGE与克隆文库等技术结合, 可克服局限性,充分发挥分离的优势。目前的发展趋势是PCR-DGGE /TGGE与其他分子技术以及微生物学、地球化学方法联合使用,这样可以减少不同技术的弊端与局限性,综合各种技术的优势,从而更真实地揭示环境微生物群落结构和功能的本质。(4)进一步丰富基因数据库, 建立更加完善的基因序列信息,为DGGE 技术对微生物的分类鉴定提供更好的信息平台。