群体感应因子对乳酸杆菌发酵中胞外多糖的合成开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述

1.1研究背景

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是指一类以糖（如葡萄糖等）为营养素发酵产生乳酸、分解蛋白质，但不产生腐败产物，不能形成芽孢，运动性低，裂殖生为生殖方式，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢阴性的细菌总称。共有9个属：乳酸杆菌属、肉食杆菌属、双歧杆菌属、孢子乳酸菌属、乳酸球菌属、链球菌属、迷走球菌属、明串珠菌属和片球菌属。前4个属呈杆状，后5个属呈球状。因乳酸菌发酵过程中会产生大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物，具有一定抑制腐败菌等作用，以及维持肠道菌群的微生态平衡，提高人体消化能力；改善制品风味；提高营养利用率、促进营养吸收；增强机体免疫功能；预防和抑制肿瘤发生；控制内毒素、降低胆固醇；延缓机体衰老等对人畜机体保健有益的生理功效。根据加工工不同可将乳酸发酵果蔬制品分为酱腌菜渍酸菜类、泡菜类、果蔬汁类及果蔬与牛乳混合发酵的饮料，可用于发酵果蔬食品的乳酸菌主要有嗜酸乳杆菌、植乳杆菌、肠膜明串珠菌；在发酵肉制品中，由于蛋白质的分解，会在发酵过程中产生一系列风味物质，使制品的营养价值和风味都得到改善，发酵肉制品生产中大多数采用啤酒片球菌和植物杆菌的单一菌种或两种的混合物；乳酸菌也可用于酿造酒类,产生的乳酸与乙醇醋化,生成白酒三大醋类之一的乳酸乙醋,提高白酒的质量,改善葡萄酒的风味。乳酸菌是目前世界上公认安全的食品级微生物,且是一种广泛应用于食品工业生产的革兰氏阳性细菌，其已广泛应用于乳制品、肉制品、蔬菜制品、软饮料等一系列食品中，故在食品工业尤其是发酵产品中发挥着重要作用，与人们的生活的关系有十分密切的联系[1-4]。

利用乳酸菌进行发酵的过程中，ph值、温度、菌种种类以及比例、时间、浓度、培养基构成等生长因子通过对其的影响从而影响产品的品质和风味，因此对于乳酸菌发酵的影响因素的研究对开发优质产品具有重要意义。目前关于乳酸菌发酵的研究多集中于菌种改造以及各项物理因子的影响，而对于微生物之间的群体感应研究较少，群体感应(quorumsensing,qs)是乳酸菌与外界环境进行信息交流的重要调控系统,特别是与细菌素合成有关的qs机制,因此对它的研究有助于构建食品级基因表达系统并解释发酵调控机理，因此对乳酸菌的群体感应调节研究具有巨大的潜在商业应用价值和学术价值。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1研究内容

2.1.1拟解决的问题：

乳酸菌合成AI-2及对生长密度影响以及对乳酸菌产胞外多糖量的影响

2.1.2拟采用的研究手段：

采用在不同时间加入不同浓度的上清液，测OD600,并采用苯酚-浓硫酸的方法测定胞外多糖的含量.

2.1.3材料及试剂

保加利亚乳杆菌ATCC8014：购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

乳酸链球菌ATCC8014：购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

2.1.5仪器与设备

2.2试验操作方法

2.2.1保加利亚乳杆菌的活化、种子液以及稀释液的制备方法

首先将购得的保加利亚乳杆菌活化后，将MRS固体培养基上的保加利亚乳杆菌接种于MRS固体斜面培养基用于菌种保藏并同时接种保加利亚乳杆菌于MRS液体培养基中,37℃振荡培养12h(转速180r/min)，作为保加利亚乳杆菌种子液。将保加利亚乳杆菌的种子液接种于新鲜的MRS培养基中，37℃振荡培养(转速180r/min)，培养至培养基浑浊（OD600为0.8~1.4）。然后用新鲜的培养基稀释（1：5000），随后振荡混匀，作为保加利亚乳杆菌的稀释液。

2.2.2乳酸链球菌的活化、种子液以及稀释液的制备方法

首先将购得的乳酸链球菌活化24h后，将MRS固体培养基上的乳酸链球菌接种于MRS固体培养基37℃培养。24h后，将MRS固体培养基上的乳酸链球菌接种于MRS固体斜面培养基用于菌种保藏并同时接种乳酸链球菌于MRS液体培养基中,37℃振荡培养12h(转速180r/min)，作为乳酸链球菌种子液。将乳酸链球菌的种子液接种于新鲜的MRS培养基中，37℃振荡培养(转速180r/min)，培养至培养基浑浊（OD600为0.8~1.4）。然后用新鲜的培养基稀释（1：5000），随后振荡混匀，作为乳酸链球菌的稀释液。

2.2.3不同上清液的制备方法

保加利亚乳杆菌培养液上清液的制备：以一定比例将保加利亚乳杆菌的种子液接种于新鲜的MRS液体培养基中，37℃振荡培养(转速180r/min)。分别继续培养一定时间。并选择上述培养过程中不同时间点的保加利亚乳杆菌培养液取样，于离心机在12000rpm，10min条件下离心，收集上清液于50mL离心管中，得到相应保加利亚乳杆菌不同培养条件下的上清液，以备使用。

2.2.4添加不同时间不同浓度上清液的乳酸菌浓度检测

对同一接种量保加利亚乳杆菌培养液2、4、6、8h取培养液制备上清液，测定其OD600值，并同时分别按体积比1∶9、2:8、3:7、4:6、1:1、6:4、7:3、8:2、9:1与保加利亚乳杆菌稀释液混合，于37℃继续振摇培养(转速180r/min)。利用分光光度计（波长600nm）检测其吸光度。乳酸链球菌的浓度检测方法同保加利亚乳杆菌。

2.2.5OD600测定方法

打开spectrophotometerUV-1800分光光度计，功能调节为吸光度测量，波长设定为600nm。检测保加利亚乳杆菌与乳酸链球菌OD600值时，以MRS液体培养基为空白，以不同时刻的保加利亚乳杆菌与乳酸链球菌培养液为待测样品，进行检测，得到相应的OD600值。

2.3胞外多糖的测定方法

2.3.1发酵液的制备

将菌液用3000r/min离心10min，收集菌体，加入2.0mL生理盐水震荡混匀，再按1.0%(v/v)的接种量接种于10.0mLMRS培养基中37℃培养24h。培养结束后沸水中灭活约20min，冷却至室温，再用8000r/min离心10min，取上清液，加入80.0%(w/v)三氯乙酸溶液(TCA)至最终浓度为4.0%，然后置于4℃冰箱沉淀蛋白12h后，再用12000r/min离心20min，取上清液4℃保存备用。

2.3.2乳酸菌产胞外多糖的测定

取发酵液1.0mL加入5.0%的苯酚试剂1.0mL、浓硫酸2.5mL静止15min，摇匀，冷水冷却30min后温度降至室温，A490nm下测吸光值。以1.0mL蒸馏水按同样显色操

作为空白对照，做3组平行。然后测得吸光值，在葡萄糖标准曲线上算出对应的糖含量。