重组漆酶的发酵优化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1本课题的意义

漆酶发现至今，经过各国学者不懈的努力，漆酶的研究进展相当迅速。其中，关于真菌漆酶的研究报道较多，真菌漆酶在环境治理等方面也发挥了很大的作用，但真菌漆酶自身的一些性质限制了其应用范围，比如真菌漆酶蛋白分子需要糖基化，在原核表达系统中不能高效表达，而且真菌漆酶在ph偏酸性条件下才具有活性并且热稳定性较差，不能在碱性、温度高等恶劣条件下应用。

但是大多数细菌生长在碱性环境中，其漆酶在碱性条件下仍具有活性。实验中发现细菌漆酶热稳定性好，在70℃条件下，细菌fmb-l820漆酶能维持酶活超过10h。细菌漆酶的基因可以在原核表达系统中进行高效表达，能够获得更多的细菌漆酶蛋白。细菌漆酶具有多种比真菌漆酶更适于工业应用的特点，如细菌生长的代时短、容易培养，细菌生长的ph值在碱性范围内等。目前，大多数真菌重组漆酶的产量较低，难以满足生产的需要。因此，采用单因素实验的方法，并研究各种因素的组合效应，对大肠杆菌重组漆酶的发酵条件进行优化。

2国内外研究概况

2. 研究的基本内容和问题

1研究目的

(1)产漆酶细菌fmb-103的鉴定及生物学特性初步研究；

(2)重组fmb-l820漆酶的发酵条件优化。

3. 研究的方法与方案

1研究方法及方案

（1）通过预实验分别对四个单因素设计合适的浓度梯度，经过接种﹑发酵﹑诱导表达三个阶段得到产生胞内漆酶的大肠杆菌发酵液。

对发酵液进行离心，破碎，离心得到粗酶液。选取合适的酶活测定方法和缓冲体系及计算酶活的方法。

4. 研究创新点

（1）细菌漆酶与真菌漆酶结构相似，同样含有4个铜结合位点，但全序列却与真菌漆酶不同。所以，其漆酶的反应条件及动力学特征就会与真菌漆酶不同。细菌漆酶比真菌漆酶有更多的优点，如存在Cu2 抗性、不需糖基化、热稳定性及酶活性的最适pH值范围广等。同时，细菌特别是大肠杆菌生长的代时短，所需营养成分简单易得，便于大规模培养；大多数细菌生长在碱性环境中，筛选出最适pH在碱性范围内的细菌漆酶，可以直接用于处理工业废水；细菌漆酶对热、卤素和碱的稳定性好，因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件和领域的扩展具有十分重要的意义。

（2）本实验中漆酶基因由解淀粉芽孢杆菌fmb-L820（本实验室保藏）基因扩增而来。选用Cu2 自诱导的方法来优化发酵条件。

5. 研究计划与进展

第一阶段（2014.3.10-2.14.3.30）：进行单因素预实验，设计合适的浓度梯度和测定酶活的方法；

第二阶段（2014.4.1-2014.04.20）：确定单因素对发酵重组漆酶的影响；

第三阶段（2012.04.20-2012.04.30）：响应面法优化发酵；