1. 研究目的与意义（文献综述）
研究意义：前药是药物分子生物可逆的衍生物,它在体内经酶或化学转化释放出有活性的母体药物。前药能改善药理活性化合物的物理化学、生物药剂学、药代动力学性质,例如,许多药物很难穿过体内的各种屏障,有些则存在水溶性差、化学性质不稳定、口服吸收不充分、进入体内前被快速代谢、脑部渗透不完全、毒性或局部刺激性等不良性质,经过前药修饰可以使这些药物顺利地用于临床治疗,另外前药还能提高药物的靶向性。
具有特定刺激响应型的前药，目前主要有两种形式，一种是简单前药，即通过与普通载体结合，从而改善药物的水溶性、脂溶性、稳定性及代谢的快慢等，提高药物的疗效；另一种是将药物负载于纳米颗粒上不仅可减小药物的毒副作用,也可被细胞识别吞噬从而进入细胞内发挥疗效。在体液循环过程中前药保持稳定，而进入细胞内的前药在细胞内形成内含体，被细胞内的溶酶体分解，解离出原药。常见的生物刺激主要包括ph,温度,氧化还原性,生物酶等。
cathepsin s作为组织蛋白酶中的一员，大量存在于淋巴细胞内的溶酶体中，可以水解蛋白质分子的酰胺键，降解细胞内蛋白质，具有重要的调节功能。故如何建立cathepsin s的体外表达体系，找到合适的方法对cathepsin s进行体外检测十分的重要。
2. 研究的基本内容与方案
基本内容：
1. 了解环境响应释药的基本原理，掌握Cathepsin作用的响应环境；
2. 明确人源Cathepsin S体外表达体系构建的目的,学会运用生物技术与生物信息学知识，设计人源Cathepsin S体外表达体系；
3. 利用NCBI网站人源Cathepsin S基因表达序列进行搜索，确定用于构建的基因序列，确认可用于基因表达的质粒系统；
4. 根据质粒系统，建立相应的表达宿主体系和分离体系,完成表达体系的构建和相关的系统参数说明。
目标：全面分析人源Cathepsin S的基因表达序列，和各种质粒系统，确认可用于基因表达的质粒系统，进一步构建合适的宿主体系和分离体系，确定合适的条件参数，完成 Cathepsin S的体外表达。
拟采用的技术方案及措施：
1. 通过NCBI网站查找人源Cathepsin S 的基因序列。
2. 在NCBI或者其他各类网站收集各类质粒系统的信息以及基因序列，通过分析对比确认适用于目的基因复制、表达和纯化的质粒系统。从六个方面分析对比，包括启动子、复制子、筛选标记、多克隆位点、分离标记和终止序列。
3. 使用DNAStar 或DNAassist软件对Cathepsin S和质粒的序列进行分析，找到目的基因的限制酶切位点信息，并确定合适的用于插入的限制酶切位点，即只存在于质粒的多克隆位点中而目的基因内部不包含的酶切位点。
4. 根据目的基因序列以及确定的适用于插入的限制酶切位点，使用DNAStar或PPrimer软件进行引物设计，把限制酶切位点加入目的基因的两端。
5. 用DNAStar完成目的基因与质粒的拼接，并选择合适的宿主系统，根据标记基因筛选重组质粒，建立分离体系，确定表达、分离与纯化的系统参数。
6. 使用DNAStar绘制完整的重组质粒图谱，建立应用手册。
设计流程图：
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3. 研究计划与安排
第1-3周：阅相关文献资料，明确研究内容，了解课题的研究现状，完成开题报告。
第4-6周：完成人源cathepsin s基因表达序列和基因表达的质粒系统的收集和分析工作；
第7-9周：完成质粒体系表达体系的设计；
4. 参考文献（12篇以上）
[1].张琦岩，孙耀华，《药剂学》(第六版)，人民卫生出版社，北京，2009.
[2].徐进宜，《药物化学》， 化工出版社，北京，2006.
[3].萨姆布鲁克 主编，《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社，2006.
