真菌纤维二糖脱氢酶在里氏木霉中的表达优化及特性研究开题报告

1. 研究目的与意义

木质纤维素生物质能源是地球上总量巨大的生物质能源，它将在未来的生物经济中扮演重要的角色。然而，纤维素酶对纤维素的水解效率低下是纤维素乙醇(由木质纤维素转化生成的燃料乙醇)工业化生产的主要瓶颈之一，也是备受关注的重要课题。纤维二糖脱氢酶被认为是连接纤维素降解和木质素降解的关键酶，是近年来研究较多的酶之一。它可以直接氧化攻击木质纤维素，也可以作为裂解性单加氧酶的电子供体，激活其对纤维素的氧化攻击活性，另外对木质纤维素酶，锰过氧化物酶，漆酶等有协同促进作用。但该酶表达存在表达水平不高，催化效率不强等问题，因此如何提高该酶的表达水平，研究相关酶的酶学性能，进一步该酶的催化效率非常必要。

2. 国内外研究现状分析

酶是指具有催化功能的高分子物质，随着人类生活的进步，酶在食品、环境、工业等方面都有着巨大的作用。并且随着生物技术的发展，它还将有着更多的应用领域。里氏木霉可以大量合成并分泌纤维素酶，是具有吸引力的基因工程宿主菌。真菌纤维二糖脱氢酶是一类黄素血红蛋白，主要由一些可降解的木质纤维素的丝状真菌合成。cdh可以氧化纤维二糖和纤维寡糖生成相应的内酯。以纤维二糖为电子供体，它还可以还原多种物质。

纤维二糖脱氢酶最早是在1974年由westermark和eriksso从黄把原毛平革菌的残体中提取得到的，cdh是许多木质纤维素降解丝状真菌所分泌的胞外酶,是一种氧化还原酶,它能通过一系列广谱性的电子受体包括醌类、苯氧自由基、fe3 、cu2 和三碘化离子,将可溶性纤维糊精、甘露纤维糊精、乳糖以及纤维二糖等高效地氧化为相应的内酯(1975，2000)被释放的内酯随后水解为醛糖酸(2011)目前所有己知的cdh均含有两个独立的结构域:n端的血红素结构域(heme)和c端的黄素结构域(flavin)。纤维二糖在flavin发生氧化,氧化反应产生的电子随后传递至heme,被还原的heme又能还原一系列底物,包括醌类、金属离子和有机染料(1991)。

cdh具有良好的热稳定性，在很多方面都被广泛应用。首先，cdh可以加速木质纤维的降解，它催化产生的羟基可以将纤维素中的微晶格降解，从而加强纤维素酶降解纤维素的能力。不仅如此，cdh还可以作为生物传感器元件，在电化学传感器中检测底物中敏感的和需要选择性测量的物质，首次对cdh传感器的研究是将cdh固定在含锇的聚合物上，这一复合物作为一个测电流的生物传感器已经被用于对纤维二糖和乳糖的检测。

3. 研究的基本内容与计划

主要内容：

1、构建cdh的表达载体并转化里氏木霉，实现在里氏木霉的活性表达。

2、比较不同里氏木霉表达效率。

3、优化表达条件，纯化酶蛋白。

4. 研究创新点

里氏木霉可以大量合成并分泌纤维酶,在诱导条件下,在发酵液中的分泌蛋白总量能达到100g/L.因此里氏木霉也是具有吸引力的基因工程宿主菌。纤维二糖脱氢酶在真菌胞外酶中的存在较为广泛，但是其真正的生物学功能目前还没有被人们所认知。本课题以自主获得的里氏木霉为研究对象，对多种不同的纤维二糖脱氢酶进行转化，获得具有更高的表达水平，催化性能更好的酶。