1. 研究目的与意义
纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是植物细胞壁的主要结构成分，是人类最宝贵的天然可再生资源。
它由纤维素合酶（cesa）在细胞质膜上合成的。
这些酶被组织成多蛋白纤维素合酶复合体（csc）。
2. 国内外研究现状分析
关于植物纤维素合成酶基因的研究，最早是在木醋杆菌(Acetobacterxylinum)中发现的。Saxena等通过比较细菌 (Acetobacter xylinum)中纤维素合成酶与其他糖苷转移酶的氨基酸序列，发现了β-糖苷转移酶的一些保守序列。对解析纤维素合成机理的研究奠定了最初的基础。不论是植物还是细菌，它们的纤维素生物合成都与β-1, 4糖苷键有关，而且它们的生物合成都是一个复杂的过程 ,受到多种因素的调节和控制，但两者在生物合成中的细节表现却是不同的。近年来对纤维素合成酶的研究已经比较成熟，从低等的藻类植物到高等的被子植物都有纤维素合成酶基因鉴定出来，用于生化功能的分析。朱煜等通过研究水稻OsCesA基因的进化和表达，发现水稻OsCesA家族的同一个基因在不同的组织部位表达模式不尽相同，但究竟有哪些纤维素合成酶参与植物次生壁的合成过程还有待进一步研究。李春秀等从中国本土的乡土树种中克隆得到了欧洲山杨PtCesA1基因的同源基因 PtoCesA1, 并且构建了全长的正义植物表达载体，PtCesA1基因正义全长转基因植株的性状表现将为阐明纤维素合成酶的作用机制提供理论依据。在四十多个不同植物中，已有164，000 个以上与纤维素合成酶基因相关的序列报道,但各纤维素合成酶基因家族存在额外的功能分裂，所以纤维素合成酶基因的精细功能和作用机制都还有待研究。多种来源的纤维素合成酶基因已被克隆，并在各种不同的系统中成功表达，其生物合成和作用机制研究均取得了重大突破，纤维素的体外大量合成依然难以实现。另外，纤维素合酶复合体合成的微纤丝结构模型最近又重新被定义。
Kudlicka K等对一些细菌、真菌和少量的低等动物进行比较发现它们的基因间相似性较低。所以体外纤维素合成，可以以真核生物、原核生物以及植物为载体，将植物纤维素合成酶基因片段导入到细菌等中构建表达载体。其主要原因是细菌结构简单，在实验过程中受到的干扰比较少。田志坚等以苎麻为原料，通过简并PCR结合RACE技术克隆苎麻纤维素合成酶基因，并通过半定量RT.PCR的方法研究其在苎麻不同组织中的相对表达量。这是首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1，并推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。张苗苗等以水稻纤维素合成酶为原料，采用原核表达的方法表达水稻CesA1、CesA2和CesA3融合蛋白，免疫新西兰大白兔，制备出纤维素合酶的多克隆抗体。也就是构建了三个纤维素合成酶的重组质粒，并在大肠杆菌中获得表达，为研究水稻纤维素合酶的作用机制提供参考。陶章生等以拟南芥为原料，将拟南芥CesA家族基因的高变区克隆到融合表达载体中，构建重组质粒，并在大肠杆菌中经ITPG诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白(GST-AtCESAs)。利用生物信息学的方法分析了纤维素合成酶家族的蛋白结构和性质，并制备出高度特异多克隆抗体，为进一步研究纤维素合成过程中纤维素合成酶的功能和调节机制等奠定了基础。David R等尝试了将木杆菌菌株纤维素合成酶基因在蓝杆菌中进行转基因表达，以获得大量的结晶纤维素，但其产量不如预期。Okako Omadjela等发现BcsA和BcsB形成细菌纤维素合成酶的催化活性核心。在将它们纯化的过程中可能某些合成纤维素的关键组件可能会游离，从而导致制备纤维素合成酶的速率大大降低。阮维程等马尾松嫩枝为原料，利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松CesA2基因的全长cDNA序列，并构建植物表达载体。希望通过纤维素合成酶在转基因植株不同发育时期不同组织的分布以及与其他蛋白和纤维素合成酶之间的动态关系，分析其作用机理。徐惠芳等以中国鹅掌楸纤维素合酶为研究对象，首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶gRNA载体的CRISPR-Cas9基因敲除系统，该载体能对CesA1基因进行定向编辑，对后续研究鹅掌楸纤维素合成酶的基因功能具有重要意义。从以上可以看出至今为止，纤维素合成酶及其相关的糖苷转移酶的蛋白晶体结构还未知，纤维素合酶的体外活性研究亦无突破性进展，纤维素合成酶复合体的具体结构形式与各包含物的具体作用也并未被完全解析，仅通过基因化学方法对纤维素合成酶复合体结构进行推断，对参与纤维素合成的纤维素合成酶相关基因的研究，对其合成机理、调节功能等仍需进一步探索。3. 研究的基本内容与计划
1、通过查找文献筛选出适宜表达分析的植物纤维素合成酶（如拟南芥，竹子，杨树中纤维素合成酶等），确定出易于转化和表达的基因并设计引物，选择质粒载体。
2、为识别表达的纤维素合成酶蛋白质，设计添加标记物如his-tag，GST或GFP等。
3、通过采用PCR方法克隆纤维素合成酶基因质粒载体，以及含有标记物的克隆基因，采用限制性内切酶将克隆基因剪切连接到表达载体，并采用凝胶电泳法和DNA测序法检验克隆基因的准确性。4. 研究创新点
在本次研究中，将采用大肠杆菌重组纤维素合成酶直接合成纤维素系统，结合免疫荧光标记法，构建质粒载体，将载体导入大肠杆菌中，采用PCR方法克隆纤维素合成酶基因质粒载体，以及含有标记物的克隆基因，采用限制性内切酶将克隆基因剪切连接到表达载体，并采用凝胶电泳法和DNA测序法检验克隆基因的准确性，有望对纤维素的合成机理展开深入研究。
