1. 研究目的与意义
目的：利用issr分子标记技术对木材进行鉴定分析，从分子水平揭示木材在dna序列上的差异，构建有效的issr指纹图谱，为木材鉴定提供技术支撑，也可以为类似研究提供借鉴。
意义：用issr分子标记技术鉴定木材，鉴定时间短、结果准确、耗材少、节约成本、不受时间和环境的限制，拓宽了木材识别的范围，提高了木材识别的精确性，可以有效防止濒危树种的非法走私，起到了对濒危树种的保护；能防止不法商人乱起名称，混乱市场，牟取暴利；能避免消费者上当受骗，从而避免引发官司。
这不仅在进出口树种鉴定中意义重大，在巨大的木制品消费市场及相关其它领域也具有广泛的应用前景和开发利用价值。
2. 国内外研究现状分析
1.国外研究概况1)新鲜树木组织国外关于植物DNA提取的研究始于20世纪80年代初研究者采用十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，CTAB)法，从植物新鲜叶片中，成功提取了高分子量(5000bps)DNA;随后，又对新鲜叶片组织DNA 的快速提取方法进行了完善近年来，科研人员对从树木新鲜叶片及嫩芽组织中提取DNA，进行了深入研究]，如从欧洲红豆杉(Taxus baccata)和象牙海岸格木(Erythrophleumivorense)等树种的新鲜叶片，以及栎属(Quercus spp.)树木的嫩芽中，均提取出了高质量的DNA从木材组织中获取高质量DNA，是开展DNA木材识别技术的重要前提90年代初开始了从树木新鲜木材组织中提取DNA 的研究与树木新鲜叶片及嫩芽组织相比，从新鲜木材组织中提取DNA更困难但已经有学者成功从刺槐(Robiniapseudoacacia)栎属(Quercus spp.)以及龙脑香科(Dipterocarpaceae)等树种的新鲜木材组织中，获得高质量的DNA2)干燥处理后的木材组织尽管从树木新鲜组织中能够获取高质量的DNA，但在生产贸易中，需识别的对象大多是干燥加工过的木材样品因此，探究从干燥后的木材组织中获取高质量DNA，并对其进行分析，更具有实用性研究表明，相比新鲜木材，从干燥木材组织中提取DNA更复杂原因是受干燥过程中高温存储时间等因素影响，木材组织的DNA普遍严重降解但近10年来，国外研究者从干燥后的木材中，提取DNA 的技术已有突破，并初步编制了实施方案如从不同存储时间与热处理后的新棒果香(Neobalanocarpus heimii)木材中，以及锯材和贴面板等木制品中，均成功提取出DNA[21从干燥的木材组织中提取DNA 的技术尚处于摸索阶段，多采用DNA 提取试剂盒法(DNeasyPlant Mini Kit，QIAGEN)，并对QIAGEN试剂盒法不断改进，从而获取高质量的DNA研究人员分别采用CTABQIAGEN试剂盒，以及PTB 试剂法(N-phenacylthiazolium bromide，C11H10BrNOS)3种方法，进行濒危树种邦卡棱柱木(Gonystylus bancanus)加工后试样DNA 的提取结果表明，CTAB 法和QIAGEN 试剂盒法提取的DNA数量和质量均较低;而样品经PTB试剂处理后，提取的DNA纯度和数量均较高提取新棒果香DNA的试验结果也证明，PTB法大大提高了加工后木材DNA提取的成功率从干燥木材的边材边心材过渡区及心材等不同区域提取DNA，并对其含量进行分析，对提高DNA的提取质量具有指导意义边材DNA含量一般高于心材，荧光显微分析表明，边材DNA主要来自细胞核和质体等细胞器;而心材DNA则来自射线细胞中的质体边材中晚材射线薄壁细胞的DNA含量高于早材。
3)DNA目的片段扩增及产物纯化聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，目前已广泛应用于基因分离基因检测克隆和核酸序列分析等研究领域PCR扩增技术可以在短时间内获得大量的特定基因片段然而，木材组织中存在大量的抑制扩增的酚多糖等代谢物，严重影响其PCR扩增成功率研究表明，DNA片段大小干燥程度储存时间和不同位置的木材组织等，均是影响PCR扩增的重要因子DNA片段短，加工程度低以及储存期较短的试样，扩增成功率较高;边材DNA扩增成功率，较边心材过渡区和心材高但由于边材含有较多PCR抑制物质，需要向裂解液中加入聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)，以提高扩增成功率通常选取叶绿体DNA(cpDNA)线粒体DNA(mtDNA)和核糖体DNA(rDNA)的目的片段，进行PCR扩增目前已成功扩增了栎属树种木材的叶绿体线粒体和核糖体的目的基因片段，以及北美红杉(Sequoia sempervirens)北美乔柏(Thujaplicata)，以及智利柏(Fitzroya cupressoides)干燥枝条的细胞核rDNA内转录间隔区(ITS)目的片段此外，也成功扩增新棒果香和日本柳杉(Cryptomeriajaponica)等木材的DNA目的片段扩增后的目的产物可以通过PCR产物纯化试剂盒，如MinElute PCR Purification Kit离空凝胶和PCR纯化系统(Wizard SV Geland PCR Clean-Up System)进行纯化，以去除PCR反应产物中残存的核苷酸酶矿物油和其他DNA样品杂质，并收集其中的DNA目的片段，为测序提供较高纯度的扩增产物4)DNA目的基因测序及序列比对对纯化后的木材组织DNA 扩增目的产物进行基因测序，然后将测得的序列与基因数据库，如美国国立生物技术信息中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)等公布的序列进行比对，以确定木材树种目前，已完成杉木(Cunninghamia lanceolata)白蜡树(Fraxinus excelsior)和楸树(Catalpabungei)等树种叶绿体DNA 目的片段的测序工作，进一步证实了DNA 方法在木材识别方面的可行性;此外通过对PCR目的产物的测序，从3种形态相似的树种中，成功鉴别出智利柏2 .国内研究概况国内研究进展与国外研究相比，我国基于DNA方法的木材识别技术研究起步较晚近年来，虽然开展了植物DNA的提取及分析工作，但研究主要集中在新鲜叶片及嫩芽组织DNA的提取扩增及分析阶段通过对rDNA的ITS序列扩增，并将所得序列在NCBI数据库中进行比对，已成功鉴定红豆杉属(Taxusspp.)树种
3. 研究的基本内容与计划
研究内容:实验的基本流程介绍(1)提取木材dna。
(2)应用issr分子标记技术对提取的dna进行pcr扩增，根据dna条带扩增情况，筛选出适用于木材的issr引物以及引物最佳退火温度。
(3)通过扩增的多态性条带间的差异构建issr指纹图谱，用于木材分子鉴定。
4. 研究创新点
传统的形态学鉴定方法在识别木材树种存在一定的局限性，利用分子生物学技术可将柏科木材识别到种，对于阻止木材的非法砍伐及贸易有重要意义，同时保护了森林资源。
