磷酸二氢钾对紫色不结球白菜叶片花青苷积累的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

1.1 本课题研究意义

2. 研究的基本内容和问题

2研究的目标、内容和拟解决的关键问题

2.1 研究目标

3. 研究的方法与方案

3 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

3.1 研究方法

① 花青素的测定参考仝月澳等（1982）的方法

② 叶绿素 a，b 和类胡萝卜素的含量参照 Lichtenthaler 等（1983）的方法

③ 可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法

④ 可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝比色法

3.2 技术路线

见附件

3.3 实验方案

试验拟采用露地栽培法，以紫色小白菜品种紫冠一号为实验材料，白菜种子经浸泡消毒后，播种于的混合基质（草炭：蛭石=1:3）中进行育苗，待植株两片真叶完全展开适应环境三四天后进行定植，分四个小区，分别编号为对照组、3、9、20，每组五个容量大小相同、规格一致的花盆，每盆定植三株植株进行培养管理。植株成长10天后开始第一次喷施，对照组喷施蒸馏水，其他分别喷施对应浓度的磷酸二氢钾溶液，十天后采样进行测定相关指标，并于次日晚八点进行第二次喷施，以后均以此类推。采样均与早晨七点半至八点间进行，且每次每株采集叶片的部位应保持一致，即第一次均采集植株下部第二片叶子，以后一次向上递推，且每盆只采集一株上的叶片，五盆为一组，共三组形成重复。

生理指标的测定

3.3.1 不同浓度磷酸二氢钾溶液的配置

试剂为纯度98%以上的磷酸二氢钾，分别称取6g、18g、40g磷酸二氢钾固体颗粒分别溶于2000ml的蒸馏水中，搅拌至完全溶解，即为3、9、20的磷酸二氢钾溶液

3.3.2 叶绿素含量的测定

叶绿素、类胡萝卜素含量的测定根据张宪政（1986）的方法。

取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物（去掉中脉），剪碎混匀。称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，放入15mL的离心管中。加95%乙醇10mL置于室温下暗储藏24h至组织变白。以提取液作对照，将叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色皿内。在波长663nm、645nm、470nm下测定吸光值（OD），并代入公式计算。

叶绿素a(mgg^-1)=(12.72A₆₆₃-2.59A₆₄₅)V/1000W

叶绿素b(mgg^-1)=(22.88A₆₄₅-4.67A₆₆₃₎V/1000W

叶绿素的总量(Tchl) (mgg^-1)=叶绿素a 叶绿素b

类胡萝卜素(mgg^-1)=[(1000A₄₇₀-3.27C_a-104C_b)/229]V/1000W

（注：V为提取液的体积；W为叶片鲜重）

3.3.3 花青素含量的测定

采用溶剂萃取法，称取0.1g的新鲜叶片，放入小烧杯中，加入10mL的1%Hcl甲醇溶液，用保鲜膜密封好防止水分蒸发，在室温下置于暗处提取24h后过滤，提取萃取液以1%Hcl甲醇溶液为空白对照，在530nm处测定其光密度值。

花青素色普相对含量计算：以每克鲜重在10mL提取液中，吸光度OD₅₃₀为0.1时的花色素昔的浓度为1个色素单位，则花色素营的相对含量=OD₅₃₀/0.lW(色素单位g^-)。其中，OD₅₃₀为530nm波长下的光密度值W表示叶片鲜重(g)。

3.3.4 可溶性糖含量的测定

采用蒽酮法：称取0.10～0.30g新鲜叶片,共三份，放入有刻度的试管中，加入5-10mL蒸馏水，用保鲜膜封口，煮30min后冷却过滤入25mL容量瓶中，取样品提取液0.5mL加蒸馏水1.5m，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630 nm波长下测其吸光度通过标准曲线方程求出可溶性糖含量，然后计算测定样品的可溶性糖含量。

3.3.5可溶性蛋白含量的测定

标准蛋白质溶液：100ug/mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白10mg，用质量分数为0.9%的氯化钠溶解，并定容至100mL即可。

G250溶液：称取100mgG250，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

操作方法：

（1）标准曲线的绘制：取6支具赛试管，按下表加入试剂

混合混匀后，向各管加入3ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5min，用1 cm光经比色皿在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，一吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

(2) 样品测定：称取鲜样0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000rpm离心10 min，取100ul于试管中（每个样品重复两次）。加入3ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白含量。

（3）计算结果：样品中蛋白质含量=CV_T/V_SW_F1000(mg/g)

C：从标准曲线上查得的蛋白含量（mg） V_T：提取液总体积ml

V_S：测定时加样量ml W_F：样品鲜重（g）

4. 研究创新点

4 特色或创新之处

① 以紫色不结球白菜为试材，探究其花青素在不同浓度的磷酸二氢钾条件下含量的变化，与叶绿素的比例进行分析比较，研究磷酸二氢钾对花青素合成的影响

5. 研究计划与进展

5 研究计划及预期进展

2013.03-2013.06，完成资料搜集及预备工作。

2013.06-2013.08，完成实验材料的准备工作。