水稻谷蛋白57H突变体D23的鉴定与基因定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 本课题意义：水稻（oryza sativa l.）是基因组研究的重要模式植物，也是世界上非常重要的农作物之一。

水稻植物种子中储存着大量的贮藏蛋白，它是稻米中仅次于淀粉的第二大贮藏物质，对于种子的萌发以及苗期生长的全过程具有重要的作用；且在谷类蛋白中，水稻蛋白因为含有一般谷类中所缺乏的赖氨酸和苏氨酸等必需氨基酸而具有很高的营养价值。

谷物种子中的贮藏蛋白，根据其溶解性的不同，可分为醇溶蛋白（prolamins，可溶解于醇中），谷蛋白（glutelins，可溶解于稀酸稀碱中），清蛋白（albumins，可溶解于水中）和球蛋白（globulins，可溶解于盐溶液中）。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标： 对已有的研究材料即水稻谷蛋白57h突变体d23进行表型的鉴定、显微观察，并对突变基因进行精细定位，为后续的基因克隆打下基础。

2.研究内容1) 表型分析：在灯箱下观察突变体的异常表型；2) 显微观察：制备突变体及野生型发育胚乳的半薄和超薄切片，比较突变体和野生型间胚乳细胞超微结构的异同，并利用制备的谷蛋白抗体进行免疫胶体金实验，观察细胞中谷蛋白的亚细胞分布；3) 利用已经构建的f2群体对d23进行精细定位；4) 图位克隆获得突变基因，并构建相应的载体进行转基因互补实验，确认突变基因。

3. 拟解决的关键问题谷蛋白最初在粗糙内质网面以57 kd前体的形式合成, 此后被转运至er 囊腔内切除信号肽, 再经高尔基体修饰并运输沉积在贮藏液泡的pb-ii中, 最终大量的谷蛋白前体被裂解为成熟的酸性亚基和碱性亚基。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1研究方法1.1表型鉴定，扫描电镜观察：在灯箱下观察该突变体的异常表型，取野生型、突变体发育12day胚乳，采用2.5%戊二醛（0.1m ph7.0）4度固定12h后，送生命科学实验中心进行后续处理；用power tome xl超薄切片机切片，采用h-7650透射电子显微镜观察；1.2 免疫胶体金：取野生型突变体发育12day胚乳，采用4%多聚甲醛 1%戊二醛固定12h，不经锇酸后固定，送生科院中心进行后续处理并切片，按下列程序进行：1) 5% h2o2漂30min，洗3次，前两次漂洗，最后1次在1.5ml 管中荡洗；（h2o2主要腐蚀切片表面，以利于试剂与蛋白的直接接触）； 2) 在 pbst中荡洗一下； 3) pbst 1% bsa 0.2m glycine 1h (10mg bsa 1ml pbst(含 0.2m glycine))； 4) 加1抗 1：12，先室温 1-2h，然后放入4度冰箱中 24-36h）； 5) pbst洗5 min3（在 1.5ml tube 中）； 6) 1:30稀释金标二抗（pbst 1% bsa用作二抗稀释液）；20ul 580ul 37度2h；7) pbst 5min3，ddh20 5min3，晾干待观察；1.3 dna提取1) 将选取的突变体的叶片剪碎于2ml小管中，加入钢珠并用液氮打碎 ；2) 在小管中分别加入ctab 600μl 65℃水浴30min； 3) 加入300-400ul氯仿：异戊醇（24:1）溶液，振荡器上充分摇匀，120rpm，30min；4) 离心，12000rpm，5min，转移200ul上清液于另一离心管中；5) 向上清液中加入2倍体积异丙醇（400ul），-20℃冰箱20min；6) 120rpm，30min，弃上清，并加入70%酒精清洗7) 弃酒精，风干，加200ul ddh2o溶解，此为dna母液；8) 将母液稀释10倍即为dna工作液。

1.4标记开发和pcr扩增由上海invitrogen公司合成ssr引物。

pcr反应总体系为10ul，dna 1.5ul，primer1.0ul,10buffer 1.0ul,mgcl2 0.6ul,dntps 0.3ul,rtaq 0.1ul,ddh2o 5.5ul.pcr反应程序为94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃复性1 min, 35 个循环; 72℃延伸10 min。

4. 研究创新点

目前对于谷蛋白57H突变体的研究较多，但是对于谷蛋白的调控基因及其合成转运过程仍存在不明确的地方，因此，继续对57H突变体进行研究对获得水稻谷蛋白合成、表达过程的新遗传信息，进一步明确其合成、表达过程，改善水稻蛋白品质具有重要意义。

5. 研究计划与进展

2.1 研究计划1）2017年9月-12月：收获d23/dularf1植株上f2的种子，收获单株种子（f2代）磨米鉴定f2代中极端个体（培养基无菌条件下发苗），进行dna提取和ssr标记凝胶电泳，连锁分析初定位。

2）2018年2月-2018年5月：基因的精细定位。

2.2 预期研究成果1）鉴定d23突变体并精细定位,再对该基因进行克隆，为逐步阐明这些谷蛋白合成关键基因的分子作用机理，形成一个清晰的谷蛋白从合成至积累的网络途径做好前期准备，也为水稻的品质改良做好理论基础。