基于重组酶介导等温扩增-侧流层析技术丁香疫霉检测方法的建立开题报告

 2021-08-08 16:00:01

1. 研究目的与意义

丁香疫霉病菌( phytophthora syringae) 是我国禁止进境的植物检疫性有害生物,主要寄生柑桔果树这种植物,可引起柑橘的根、茎、叶、果实多种病害。

病菌可侵染柑橘引起果实褐腐、枝干流胶、根颈部脚腐和根腐,引起柑橘果树的毁灭性危害,影响果实产量和品质,带来重大经济损失。

同时中国是柑橘的重要原产地之一,柑橘资源丰富,优良品种繁多,有4000多年的栽培历史。

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2. 国内外研究现状分析

建立一种快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术检测丁香疫霉。

目前的难点在rpa技术引物和探针的长度较 pcr 的要长,且引物和探针的设计和筛选较为繁琐与困难。

hatem等以沙门氏菌 的internal transcribed spacer 1 (its1)序列设计引物和探针,建立了rpa(recombinase polymerase amplification)测流层析检测方法。

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3. 研究的基本内容与计划

研究内容:(1)丁香疫霉基因组dna的提取;(2)特异性靶标的发掘及其引物筛选和重组酶介导等温扩增(recombinase polymerase amlification,rpa)技术实验引物探针设计;(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。

以dna为模板,进行rpa扩增,向装有检测干粉的反应单元管中加入缓冲液buffer 29.5μl,10μm的上游引物2.1μl,10μm的下游引物2.1μl,探针0.6μl,dna 2.0μl;mgac 2.5μl加在八连管的盖子上,共计50μl扩增体系,小心翻转盖上,将rpa扩增体系充分混匀,5,000g离心10s,置于39℃金属浴上反应30min,温育4 分钟后拿出反应管再次混匀,离心3-5秒,放入水浴锅继续反应30 min。

当试纸条出现两条棕色条带,一条位于质控区内,一条位于检测区,则结果为阳性,表明样本中含有丁香疫霉;当试纸条只有质控区出现一条棕色条带,检测区没有条带,则结果是阴性,表明样本中不含有丁香疫霉。

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4. 研究创新点

研究中丁香疫霉DNA特异性高的区域设计引物和探针筛选出最优组合,并与普通PCR进行比较,分析建立的丁香疫霉RPA检测方法的优缺点。

RPA是被看作可以取代PCR的核酸检测技术,具有等温检测、耗时短、操作简便,花费较少的优点。

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