观赏海棠SSR-PCR反应体系的优化开题报告

1. 研究目的与意义

观赏海棠是一类综合观赏效果最好的木本观赏植物，由于海棠品种多样、品种间遗传关系复杂，迫切需要分辨率高、稳定性强的分子标记进行研究。ssr标记具有在基因组中数量丰富、多态性高、呈共显性遗传、稳定性好等特点。本研究将对海棠ssr-pcr反应体系进行优化，为海棠品种间的鉴定及品种亲缘关系研究建立基础。

微卫星或简单重复序列，简称ssr。是指在生物基因组中存在一个或几个碱基可变次数的串联重复序列，以在基因组上的许多位点分散分布为特征，最短的基元分布的位点数最多。ssr在基因组中分布广泛。作为一种理想的分子标记技术，已成功的应用品种鉴定、物种的分类系统比较以及作为构建遗传图谱的重要工具。

本研究通过单因素实验设计，正交实验设计，对观赏海棠ssr-pcr反应体系中模板dna、mg^{2 、}dntp、引物和taq聚合酶浓度进行5因素4水平优化，以建立快速稳定的观赏海棠ssr-pcr反应体系，并利用优化体系对ssr引物进行筛选。选出条带清晰、多态性好且在多个种内都能扩增出来的ssr标记。

2. 国内外研究现状分析

我国拥有24种苹果属植物，蕴藏着大量的可用于观赏的种类和类型，如海棠花、垂丝海棠、湖北海棠等。观赏海棠(OrnamentalCrabapple)是欧洲育种家以原产亚洲的山定子(MalusbaccataBorkh.)、苹果(MaluspumilaMiller.)、三叶海棠(MalussieboldiiRehd.)、楸子(MalusprunifoliaBorkh.)、新疆红肉苹果(MaluspumilaNiedzwetzkyana.)和原产北美的奥涅海棠(MalusfuscaSchneid.)、草原海棠(MalusioensisBrit.)、野香海棠(MaluscoronariaMill.)为亲本，通过大量的偶然实生选育出的木本观赏植物，目前存在着亲缘关系难以确认的问题。

石胜友等(2008)用AFLP分子标记技术对苹果属小金海棠起源进行研究，发现小金海棠与变叶海棠、陇东海棠有较近的亲缘关系，并推测小金海棠可能是变叶海棠的某一类型和陇东海棠的自然杂交种。祝军等(2000a,2000b)用P44 /M64引物构建5个苹果矮化砧木(M7、M9、M26、M27、MM106)的基因型指纹，发现各基因型扩增带型互不相同，可一一分开, 且各基因型分别拥有自己的特征带。另外应用引物P32/M46构建的苹果品种的AFLP指纹图谱中，供试样品国光、金矮生、摩里士、王林和旭有特异带，根据各自的特异带或差异带可以区分供试的25 个苹果品种。鲍露等(2005)利用AFLP技术成功的区分了葡萄品种超藤和藤稔两个亲缘关系很近的品种。杨朝东等(2004)用AFLP对梅花杂交后代进行了快速鉴定。韩蕾（2008）分别利用AFLP和SSR技术对苹果砧木以及SH40自然实生后代进行父本鉴定。赵天田等（2010）用AFLP技术，对以苹果属观赏海棠品种王族为母本，以5个材料为父本的38个实生单株进行父本鉴定

3. 研究的基本内容与计划

1. 采集相关品种海棠的幼嫩叶置于-70℃超低温冰箱保存，然后采用ctab法提取模板dna，置于-20℃保存备用；

2.利用已有文献中公布的ssr引物进行初始pcr扩增，并根据电泳结果，结合正交设计表设置不同因素的梯度水平；

3. 根据正交设计的体系进行扩增，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行打分评比，筛选出最优体系；

4. 研究创新点

在各种DNA分子标记中，与RFLP、RAPD\AFL等相比，SSR标记为共显性标记，具有简便、快速、稳定性强和等位基因多样性高等特点，在基因组研究中作为一种主要的分子标记技术，已经广泛的应用于遗传图谱的构建，比较基因组研究，遗传多样性分析等。但目前为止，国内尚未有对观赏海棠SSRPCR体系优化。这一研究对以后观赏海棠品种分析和鉴定提供了工具，加速了种质资源分子系统学和遗传育种学的研究进程。