1. 研究目的与意义
CRISPR-Cas，一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中，CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常21-48bp，重复序列之间被26-72bp间隔序列（space）与靶基因进行识别。Cas存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR 系统分为3 种类型，现在常用的CRISPR- Cas 系统由类型Ⅱ系统改造而来。类型Ⅱ系统的特征性蛋白为 Cas9 蛋白，只需该蛋白就可以引起免疫性。
CRISPR-Cas9系统介导的基因定点编辑技术，可实现由sgRNA指导Cas9核酸酶对靶基因的DNA进行定点修饰，其特异性依赖于sgRNA与靶标位点通过碱基互补配对，并且靶标位点必须含有PAM序列（NGG）。
CRISPR-Cas9系统作为一种新兴的基因定点编辑工具已在多个植物中成功得到应用，但在美洲黑杨中的应用尚未见报道。本课题以杨树Pds基因为基础，构建CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除PtPds基因的表达载体，并利用农杆菌介导CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除杨树Pds基因，以获得高效的敲除拟南芥基因的遗传转化体系。2. 国内外研究现状分析
2013 年，中国、美国和英国的3个研究团队同 时报道了利用 CRISPR/Cas9 系统在植物中实现了对内源基因的定点突变：中国科学院遗传与发育生物 学研究所高彩霞团队利用 CRISPR/Cas9 系统定点突变了水稻和小麦两个作物的 OsPDS和TaMLO等5个基因，并通过同源重组 DNA 修复途径，利用单链寡核苷酸DNA(Single-strain DNA , ssDNA)作为模板 在基因组特定位点精确插入了 12 bp 序列；哈佛大 学和塞恩斯伯里实验室团队利用该技术分别在拟南 芥和烟草中敲除了内源AtPDS和NbPDS等基因。 这些研究首次证实了 CRISPR/Cas9 系统能够用于植 物的基因组编辑。到目前为止，人们利用该系统先后在模式植物拟南芥、烟草以及水稻、 小麦、玉米、高 粱、二穗短柄草、番茄等作物中成功实现了基因组编辑，这也是目前唯一在植物中实现了广泛应用的基因组定点编辑技术。
然而，多数研究都是在草本植物中展开，该技术在木本植物中的应用报道目前还比较少。
作为全球种植面积最大的速生经济林树种，杨树具有重要的商业价值和生态价值。2006年，杨树作为首个完成基因组测序的多年生木本植物，其基因组信息的公布为在该物种中开展功能 基因组学的研究奠定了基础。因此，近年来杨树已 经发展为全世界公认的木本模式植物。然而，由于 木本植物自身固有的特点，对杨树基因功能的研究 存在诸多技术困难。尤其是其非常长的繁殖周期和 较低的遗传转化效率，限制了遗传研究手段在杨树 中的应用，导致人们迄今仅获得了极少数的杨树基 因突变体。因此，如果能通过新的技术手段实 现高效的杨树基因突变，将十分有利于林木的遗传 改良研究。3. 研究的基本内容与计划
1研究计划
1.1 ptpds基因sgrna的设计和合成
1.2 ptpds基因sgrna表达盒的pcr扩增和琼脂糖凝胶检测
4. 研究创新点
CRISPR-Cas9系统作为一种新兴的基因定点编辑工具已在多个植物中成功得到应用，但在美洲黑杨中的应用尚未见报道。
本课题以杨树Pds基因为基础，构建CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除PtPds基因的表达载体，并利用农杆菌介导CRISPR-Cas9植物基因编辑系统敲除杨树Pds基因，以获得高效的敲除拟南芥基因的遗传转化体系。
