1. 研究目的与意义
松材线虫病是国际公认的松属树种特大毁灭性病害。目前该病害在我国17 个省（市）的 181 个县级行政区均有发生，累计致死松树 6 亿多株，导致的直接、间接经济损失总计约 500 亿元，严重影响我国的经济、社会和生态发展。而到目前为止，该病害的防治问题扔没有得到有效解决。
在实验室的前期工作中，从美国松材线虫体表分离了一种嗜麦芽窄食单胞菌，该细菌具有产毒能力弱，繁殖能力强，抗逆能力强等特点，具有一定的生物防治潜能。为进一步了解该细菌的生防机理，了解该细菌在松材线虫体表的存在动态，分析了解在该细菌的存在下松材线虫体表细菌的多样性非常必要。在本研究中，通过分子生物学手段研究松材线虫在松材线虫病生防菌株Smal-007干预下体表细菌系统发育的多样性，探索生防菌株与其他致病菌、松材线虫的互作关系，为松材线虫病的生物防治提供理论基础。
2. 国内外研究现状分析
国内外研究较多的是关于松材线虫体表细菌的研究。
松材线虫体表潜藏了大量细菌，而正是这些细菌产生了毒性物质。
kawazu (1998)等从松材线虫上分离到了能产生致萎毒素的3种细菌:腊状芽孢杆菌(bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和巨大芽抱杆菌(b.megaterium)。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容包括以下几方面：（1） 松材线虫体表细菌的接种；（2） 接种后线虫dna提取；（3） 16s rrna基因的v4区片段扩增；（4） 基因测序；（5） 生物信息学分析
（1）材料：松材线虫病死木（野外采集） small-007菌株（本实验室保存） 灰葡萄孢菌株（本实验室保存） 马尾松松苗（由本实验室温室提供）
（2）方法： a、野外采集松材线虫病死木，采用贝尔曼漏斗法对线虫进行分离，经过形态和分子鉴定后,确定为松材线虫，待用。 b、将保存的small-007菌株活化，制备发酵液。利用small-007菌株发酵液对分离自病死木的野生松材线虫进行定殖，并将定殖的线虫于灰葡萄孢培养基上传代培养，待用。 c、将经small-007菌株定殖的传代培养的松材线虫接种于马尾松苗，30d后对马尾松内松材线虫进行分离，将分离所得线虫进行传代保存。 d、对a、b、c所得线虫分别进行总dna的提取、16s rrna基因的v4区片段扩增分析、pcr产物纯化与定量、dna双末端修复与富集、验证文库、均一化并混合文库、上机测序。 e、数据处理。 a原始数据处理与样本序列数目统计。 b生物信息学分析: 应用 qiime根据序列的相似度，将序列归为多个otu,otu产出后，统计各个样品含有otu情况及每个otu中含有序列的数目,通过寻找最近亲缘物种的方法，得到每个otu的分类学信息,选取相似度在97%条件下的otu生成预期的稀释曲线，并利用软件mothur计算丰富度指数chao1和ace，覆盖度指数以及多样性 指 数simpson和shannon指数进行alpha多样性分析.利用excel、pcoa、correlation聚类法分别进行数据处理、细菌群落分布、主成分分析和聚类分析。
4. 研究创新点
Smal-007菌株是从美国松林获得的一株嗜麦芽窄食单胞菌，已经证明该菌株可以替代我国松林内的有毒菌株，对松材线虫病有一定的生防潜能。Smal-007菌株的生防机理是替代松材线虫体表其他致病或产毒细菌，但我们对该菌株的替代模式或规律还不太了解。而用分子手段分析松材线虫体表在Smal-007菌株干预下的微生物变化动态，有助于我们对Smal-007菌株的生防机理进一步了解，对松材线虫病的生物防治有重要意义。
