1. 研究目的与意义
松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）是重要森林有害生物，造成松树大量死亡，带来严重的经济损失和生态破坏。关于松材线虫的致病机理目前还不清楚，松材线虫的致病基因也尚不了解。通过基因芯片比较线虫在灰葡萄孢上培养与接种发病过程中基因表达差异，发现接种到松树上的松材线虫部分基因表达量明显增加，如果胶裂解酶基因、细胞色素p450,UGTs,ABC转运基因。功能注释发现这些基因参与了细胞壁降解，解毒，繁殖过程。
细胞色素P450基因是最庞大的超基因家族之一，存在于几乎所有的生物体内。细胞色素P450酶系统催化内源性和外源性化合物的代谢。内源性和外源性底物的生物转化使这些化合物具有亲水性或极性，然后才能被排泄。如甾体、脂肪酸或带有烯烃、烷烃、芳香环或杂环取代基的化合物。
接种到松树上的松材线虫CYP家族相关基因表达量明显增减，说明这一家族的基因与松材线虫的致病存在一定关系。因此，对松材线虫CYP家族相关基因的克隆与序列分析为其功能研究奠定一定基础，有助于进一步揭示松材线虫的致病机理。2. 国内外研究现状分析
松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(Sleiner＆Buhrer)Nick为伞滑刃属植物寄生性线虫，其寄主主要为松属植物，松材线虫入侵寄主后引起的寄主萎蔫并很快枯死的毁灭性疾病，称为松材线虫病．该病的发生与扩散涉及到寄主、松材线虫、传媒天牛以及相关的环境条件等多种因素．其中松材线虫为根本因素．我国自1982年在南京中山陵首次发现松材线虫以来，至今已在广东、江苏、四川等省的的一百一十多个市县发现．目前对松材线虫的研究主要集中在其致病机理、检疫检验以及如何区分松材线虫与其他伞滑刃属线虫尤其是拟松材线虫等方面，研究水平已经深入到酶学与分子生物学。在对松材线虫基因的研究中，目前已研究过的松材线虫基因主要分为三个方面：一是应用于检疫检验的研究，主要研究的基因有rRNA基因，利用rRNA的ITS区核苷酸序列进化速度较侠的特点，能准确区分松材线虫与其近缘种；二是探讨致病机理的研究。主要研究了纤维索酶和果胶酸裂解酶等在食道腺细胞中表达的酶基因。发现纤维索酶基因町能是由于基因横跨作用从细菌迁移到松材线虫基因组内，有助于研究松材线虫致病性的起源；三是对松材线虫生长发育相关基因的研究，为控制松材线虫的生长发育提供了依据。
1987年Nebert等人提出了根据氨基酸序列的同源性将细胞色素P450分为家族和亚家族的系统命名法，与以往的P450蛋白质生理功能为基础的命名法共同应用。P450还具有独特的催化作用原理，即将分子氧断裂并将其中一个氧原子插入到底物内。细胞色素P450催化反应过程涉及多个步骤，典型的反应是以NAD(P)H作为电子传递系统，以氧气为辅助底物，将分子氧还原，并将其中一个氧原子加到底物（RH）中。在功能方面，细胞色素P450以膜结合和可溶性2种形态存在于生物体内。主要分布于内质网、微粒体、线粒体上，也有的存在于液泡膜和质膜上。由细胞色素P450参与，能够催化多种内源、外源物在体内的氧化反应，使化学物质的活性或毒性、药物的药效发生变化。细胞色素P450对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用，其种类、催化反应类型的多样性及底物的广谱性使其成为自然界中最具催化多样性的生物催化剂。在动物中。P450主要参与大部分药物和杀虫剂等外源物的生物氧化作用，以及固醇类的生物合成、脂肪酸和类固醇激素等内源性底物的氧化代谢作用。它使进入机体的外源物经代谢后向两个方向发展：代谢解毒和代谢活化。代谢活化后的产物有较强的毒性，甚至产生致畸、致癌效应。在植物中P450介导的反应范围更广，包括植物激素、信号分子、防御相关的化合物和结构次级天然产物(structuralsecondarynaturalproducts)的生物合成，以及除草剂的解毒等。
3. 研究的基本内容与计划
（1）松材线虫总rna提取、cdna合成（2013、11-12）
利用rna提取试剂盒分别提取接种松树与灰葡萄孢松材线虫的rna并转化为cdna
（2）松材线虫cyp家族相关基因的克隆（2014、1-2）
设计引物通过3和5race反应，产物连接质粒载体，阳性克隆测序、拼接获得相关基因的全长cdna。
4. 研究创新点
本课题在通过基因芯片比较线虫在灰葡萄孢上培养与接种发病过程中基因表达差异，发现接种到松树上的松材线虫细胞色素P450家族部分基因表达量明显增加的基础上，利用RACE 技术对参与致病过程的细胞色素P450家族主要基因进行cDNA全长的克隆为其功能研究奠定一定基础，有助于进一步揭示松材线虫的致病机理。
