铅(II)和镉(II)在黑曲霉溶液中的固定和竞争吸附的研究开题报告

 2022-01-31 09:01

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

一、课题的意义、国内外研究进展以及应用前景

1. 选题意义

随着世界经济的发展,人类活动的增强,化工、印染、采矿等工业带来的三废(废气、废水、废渣)的超标排放,以及农用化学品过量使用造成严重的环境污染,特别是重金属污染越来越严重。根据中国农业部调查,在约140万hm2的污水灌区中,遭受重金属污染的土地面积占污水灌区面积的64.8%。重金属一旦污染环境,很难自然修复,并可随食物链畜积和传递,极大的危害了人类与在自然界其他生物的健康。

当前最引起人类关注、毒性最大、污染最广泛的是镉、汞、铅、铬、砷等。铅、镉都属于五大污染重金属之一,其污染范围很广。近几十年来,铅(Pb)的全球年释放量达到783,000 t。据统计,我国约有1.3×104 hm2耕地受到铅污染,致使粮食减产达1.0×107 t。含铅汽油的使用也加重了土壤中铅的污染。近些年,在对蔬菜等可食用农作物的检测过程中发现均有铅超标的现象。数据显示:世界上40%的毒性污染问题是由铅直接引起的。铅最终会危害人体健康,特别是对儿童的危害最大。

在所有的污染土壤的重金属元素中,镉(Cd)以移动性大、毒性高、污染面积最大被称为“五毒之首”,成为最为关注的元素。重金属镉是生物体所必需的非必需物质,可以在食物链中积累。由于镉化合物大多溶于水,因此不论从消化道、呼吸道都能被吸收进入机体,对全身器官系统发生作用。镉的所有化学形态对人和动物都有毒。与羟基和氨基结合的镉可抑制多种酶系统,从而影响肝肾器官酶系统的正常功能。摄入或吸入过量的镉可引起肾、肺、肝、骨、生殖效应及癌症。国际癌症研究署(IARC)把镉归类为第一类人类致癌物。

关于镉污染所引发的事件,在世界各地发生得很频繁。据统计,全世界大约每年要排放镉1.0×106 t,随着工业的不断的发展,还在继续增长。中国约有13000 hm2耕地受到镉污染,涉及11个省市的25个地区。农业部农业环境监测总站监测结果表明,污灌区的镉污染面积最大,达381.2万hm2,占重金属超标面积的56.9%,污灌区生产的农产品镉超标率达10.2%。

目前采用的针对重金属污染的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复。其中,传统的物理和化学修复技术去除污染物不彻底,常导致二次污染,从而带来一定的环境健康风险。而微生物修复具有相对处理费用低、效果好、对环境的影响低并且可以就地进行处理等优势。其原理是利用某些微生物对重金属的吸收、沉淀、氧化还原等作用从而降低重金属毒性。微生物活动可以通过自身分泌有机酸和生物吸附等过程,进而影响环境中重金属的迁移和价态、降低重金属的生物有效性。因此,研究重金属元素对微生物的毒性作用及其机理,并通过研究筛选出对重金属耐受性强、吸附性高的微生物,对污染治理具有重大意义。

重金属污染案例中最常见的是多元素污染。采矿、钢铁冶炼以及电镀工业产生的废水大多同时含有铅和镉等多种重金属。实际上,重金属污染多具有伴生性和综合性。复合重金属污染的对微生物产生的毒理效应与单一污染不同,其相互作用机理更加复杂。考虑到金属污染通常是由于多种金属的存在而产生的,在今后的研究中,应重视不同金属离子之间因为竞争作用而引起的毒性变化。以期为重金属胁迫下微生物的生理变化和微生物污染修复技术的深入研究提供理论参考。

2. 国内外研究进展

黑曲霉(Aspergillus niger)作为一种模式微生物,它们因其较强的有机酸分泌能力而被成功地应用于铅的修复。与细菌相比,丝状真菌可以分泌大量的草酸、酒石酸、柠檬酸等,具有一定的解毒作用。低分子量有机酸在水环境中普遍存在,影响水体中重金属的运移。柠檬酸是LMWOAs中应用最广泛的一种。在所有真菌中,黑曲霉是分泌柠檬酸最多的菌种。目前,世界上99%的柠檬酸产量是通过发酵获得的,80%左右是通过黑曲霉发酵获得的。这种抑制作用可能是有机酸和重金属离子的络合作用和静电相互作用的结果。

利用真菌作为生物吸附剂去除工业废水中的重金属已成为一种高效、经济的环境策略。在铅胁迫下,微生物细胞表面的羧基、羟基、羰基、酰胺基和磷酸基与铅发生反应,形成沉淀。由于氧化应激效应,铅可以刺激微生物细胞中抗氧化系统的活性。此外,铅与草酸反应形成不溶于水的草酸铅矿物(25℃,Ksp = 8.5110-10)。草酸是生物体产生的最常见的低分子量有机酸(LMWOA),具有高酸度常数(pKa1=1.25, pKa2=4.27),在调节细菌-真菌相互作用和生态系统功能方面起着关键作用。黑曲霉主要是通过沉淀草酸金属来解毒的,因此它们对于铅具有很强的抗性。

微生物细胞含有与Cb2 结合的大分子,包括葡聚糖、脂质、几丁质和几丁质衍生物。此外,镉还可以与微生物的天然代谢物草酸螯合,产生水不溶性草酸镉(25℃,Ksp = 1.4210-8)。研究表明,真菌对镉的耐受性明显低于铅。这是因为Cd2 比Pb2 具有更高的迁移率。因此,即使在低浓度下,镉也能被微生物细胞更快地吸收。另外,镉对细胞的毒性也体现在它的阳离子优势,如Cd2 。Cd2 可以取代细胞内原有的功能离子,扰乱细胞的正常生理代谢。

复合重金属污染对微生物的毒性不同于单一污染。土壤系统试验也表明,与单独镉处理相比,Cd/Pb混合处理对土壤微生物活性的抑制作用较小。因此,当铅和镉同时作用于同一生物体时,它们可能在很大程度上具有竞争性毒性和吸附作用。

3. 应用前景

金属污染是目前最严重的环境问题之一,威胁着生物体的健康。其中,铅和镉是两种常见的有毒重金属。微生物修复凭借其成本低、效率高以及不会给环境造成二次污染等特点,已经成为目前修复技术的热点。其中,丝状真菌(如黑曲霉)因为其自身的代谢优势,例如分泌大量有机酸,已经成功用于重金属的生物修复。因此,我认为探讨在重金属胁迫下模式微生物(如黑曲霉)的生理变化,对今后的生物修复具有重要意义。考虑到重金属污染的结合性以及伴生性,在未来研究中,不仅要阐明铅、镉单独存在时对微生物的刺激作用和毒性效应,同时也要研究铅镉混合体系对于微生物的竞争毒性和作用机理。以此推进在铅、镉重金属胁迫下微生物毒理效应的研究,同时也为微生物修复重金属污染进一步发展提供更加有力的科学依据。

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2. 研究的基本内容和问题

二、研究的目标、内容和拟解决的关键问题

1. 研究目标

A. 探究Pb2 和Cd2 的化学行为以及毒性差异

B. 探究黑曲霉在混合重金属和单一重金属胁迫下的生理变化

C. 探究混合金属体系下黑曲霉表面吸附的重金属,明确哪种金属更易被吸附

D. 模拟培养基中的生物矿化过程

2. 研究内容

本研究计划探讨Pb2 和Cd2 对黑曲霉的毒性差异。此外,通过检测真菌在混合重金属和单一重金属胁迫下的分泌物和酶活性变化,阐明铅镉混合体系对黑曲霉的毒性作用和竞争机制。检测溶液中Pb2 、Cd2 、P的浓度,并针对吸附在黑曲霉表面的重金属进行分析,探究Pb2 和Cd2 在生物吸附中的竞争作用。最后,本实验还将利用GWB软件,模拟随着pH的改变,在含有混合重金属和单一重金属溶液中的成矿过程。

3. 拟解决的关键问题

A. 铅离子和镉离子的化学行为和毒性的区别是什么?

B. 黑曲霉的分泌物是如何变化的,是否说明毒性的区别。

C. 黑曲霉表面铅镉竞争的结果是什么, 最后谁优先被吸附?

D. 若培养体系中铅和镉的比例变化,对黑曲酶的生理活性是否产生影响。

3. 研究的方法与方案

三、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1. 研究方法

测定培养基中金属离子浓度、有效磷含量、黑曲霉分泌的有机酸及相应的酶活性来评价真菌活性:采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测培养体系中P、Pb2 、Cb2 的浓度;采用高效液相色谱法(HPLC)对黑曲霉分泌的有机酸进行分析;利用酶活性测试试剂盒测定黑曲霉线粒体中的丙酮酸脱氢酶(PDH)和柠檬酸合成酶(CS)的活性。此外,采用扫描电子显微镜(SEM)对黑曲霉的形貌进行研究,并且使用能谱仪(EDS)对吸附在黑曲霉表面的重金属进行分析。最后,利用GWB软件模拟培养基中的生物矿化过程。

2. 技术路线(见图片)

3. 实验方案

实验材料

从大豆根际土壤中分离得到黑曲霉。以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)为培养基,在28℃下培养5天,形成孢子。培养基用无菌水浸湿,然后用刷子小心地从盘子表面刮去孢子。然后用三层无菌纱布过滤悬浮液,以去除菌丝碎片。

实验处理:

黑曲霉的培养基共分为三种处理和一组空白对照(CK):

a) 1Pb1Cd 处理: Pb2 的摩尔浓度与Cd2 相同,即Pb2 =Cd2 =8.9310-4 mol/L (对应的Cd2 的质量浓度为100 mg/L)。

b) 2Pb1Cd处理: Pb2 的摩尔浓度增加了一倍,即1.78610-3 mol/L。Cd2 仍然是8.9310-4 mol/L。

c) 0Pb1Cd 处理: 该处理只有8.9310-4 mol/L的Cd2

d) CK:不添加重金属离子。

实验步骤

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)在121℃下灭菌20分钟,用于真菌培养。采用固体Pb(NO3)2、Cd(NO3)2粉末制造毒性环境。将1 mL的孢子悬浮液置于250 mL的锥形瓶中,用100 mL的PDA培养基培养。然后,在28℃下孵育5天,并保持180转/分钟的振荡。分别于1、3、5天进行破坏性采样,每个处理重复3次。样品的培养基要透过0.22μm滤膜(PES)。采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测培养基中P、Pb2 、Cd2 的浓度。培养1、3、5天后,将过滤后的溶液转入小的HPLC瓶中,用HPLC (Agilent 1200)对黑曲霉分泌的有机酸的含量进行分析。收集黑曲霉细胞,采用丙酮酸脱氢酶活性试剂盒和柠檬酸合成酶试剂盒检测酶活。

此外,将过滤的沉淀在65℃干燥24小时进行SEM分析,采用牛津Aztec X- max 150能谱仪(EDS)进行半定量分析(采集时间:90 s)。最后,利用GWB软件模拟培养基中的生物矿化过程。

4. 实验可行性分析

首先,本实验依托的生态系统生态学土壤微生物实验室拥有很成熟的微生物实验平台。整个团队一直致力于微生物与重金属相互作用的研究,并且各项指标的测试技术都很成熟。其次,已经有大量的研究表明重金属铅和镉对微生物细胞具有毒性作用。而黑曲霉作为一种典型的丝状真菌,对重金属具有一定的耐受性。因此,理论上其在重金属的胁迫下具有一定的生存能力。在此基础上,通过黑曲霉来研究铅和镉的毒性作用和竞争机制具备很强的可行性。

4. 研究创新点

四、特色或创新之处

虽然,黑曲霉因其较强的有机酸分泌能力已被成功应用于修复铅污染,但重金属对黑曲霉的毒性仍然值得关注。特别是考虑到水和土壤修复的长期目标,环境真菌的耐受性是成功的决定性因素。土壤体系中的吸附实验表明,由于竞争效应,镉的吸附量因为其他竞争金属的存在而降低。而铅的吸附不受溶液中其他竞争金属的影响。但是,此结论是否适用于生物界面还未有研究。此外,目前还没有明确的证据来解释铅镉的竞争机制。我们猜想它们竞争的原因可能是对位点的竞争,即对细胞表面和代谢系统上的活性位点和吸附位点的竞争。因此,在我们的研究中,会更加重视由于竞争引起的金属离子的毒性变化和吸附变化,特别是阐明它们之间的竞争机制。为微生物修复重金属污染提供了更全面的科学依据,并且有利于生物修复技术的进一步发展。

5. 研究计划与进展

五、研究计划及预期进展

2019.12 完成实验部分

2020.03 完成数据的整理分析以及软件模拟部分

2020.04 撰写毕业论文

2020.05发表一篇SCI论文

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