1. 研究目的与意义
马尾松(pinusmassonianalamb.)是我国松科松属树种地理分布最广的一种，自然分布地带200多万平方公里，集中连续分布区横跨我国大陆东南部(湿润)亚热带的北、中、南三个亚带。马尾松自然分布界线:北界秦岭(南坡)、伏牛山、桐柏山、大别山、沿淮河到海滨一线，即暖温带与北亚热带的交界线。西界在四川盆地西缘二郎山、大西岭东坡。向南大致沿着清衣江到贵州赫章、六枝，沿北盘江到广西百色一线。南界沿广西十万大山西端国境线上，向东抵达雷州半岛及东南沿海一线，直至海南岛也有零星分布。东界抵东海之滨及舟山部分岛屿(定海)，台湾北部低山及西北海岸也有零星分布。
马尾松又名青松、山松、纵松，常绿乔木，高达45m，胸径1.5m；树皮红褐色，下部灰褐色，裂成不规则的鳞状块片；枝平展或斜展，树冠宽塔形或伞形，枝条每年生长一轮，但在分布区南部则通常生长两轮，淡黄褐色，无白粉，稀有白粉，无毛；冬芽卵状圆柱形，褐色，顶端尖；针叶2针一束，稀3针一束，长12-20cm，细柔，微扭曲，两面有气孔线，边缘有细锯齿；树脂道约4-8个，叶鞘初呈褐色，后渐变成灰黑色，宿存。雄球花淡红褐色（成熟时呈黄色），圆柱形，弯垂，聚生于新枝下部苞腋，穗状；雌球花单生或2-4个聚生于新枝近顶端，淡紫红色；球果卵圆形或圆锥状卵圆形，长4-7cm，径2.5-4cm，有短梗，下垂，成熟前绿色，熟时栗褐色，陆续脱落；种子长卵圆形，长4-6mm，连翅长2-2.7cm；子叶5-8枚，长1.2-2.4cm；初生叶条形，长2.5-3.6cm，叶缘具疏生刺毛状锯齿。花期4-5月，球果第二年10-12月成熟。
马尾松为喜光、深根性树种，不耐庇荫，喜温暖湿润气候，能生于干旱、瘠薄的红壤、石砾土及沙质土，或生于岩石缝中，为荒山恢复森林的先锋树种。常组成次生纯林或与栎类、山槐、黄檀等阔叶树混生。在肥润、深厚的砂质壤土上生长迅速，在钙质土上生长不良或不能生长，不耐盐碱。
2. 国内外研究现状分析
我国马尾松遗传改良的研究始于1958年，当时马尾松种源试验是原福建林学院的俞新妥教授率先开展。此后由于各种各样的原因，马尾松遗传改良研究工作的进展比较慢，直到70年代末马尾松才被列为主要树种才开始展开研究，1983年后马尾松良种选育正式列入国家攻关项目。在地理变异和种源筛选、种子园建立技术、优树子代测定、无性系选育、无性繁殖等方面经过近20多年的研究取得了较大的进展，在推进马尾松人工林的良种化进程方面起到了积极的作用。但是种子园种子产量在生产实践中较低且大小年明显，导致马尾松良种供应不足。而且马尾松是一种在运用常规技术无性繁殖比较困难的树种。近年来，虽然在研究马尾松扦插繁殖技术方面有所突破，实现了5年生以下母树穗条扦插的生根率能够达85%；但随着母株年龄递增，马尾松扦插繁殖能力明显的随着年龄递减，极大地阻滞了良种无性扩繁的步伐。为突破上述问题，开启马尾松良种无性系化的大门，目前虽然已开展了马尾松的组培研究，但没有彻底解决生根问题，需要在炼苗和移栽方面进行进一步的实验，整个体系仍然需要进行完善，要大规模应用于生产仍有差距[25,26,27]。因此，进一步发展马尾松快速繁殖技术，开展马尾松快速繁殖和体细胞胚胎发生等技术的研究，不仅能够加速马尾松优良遗传材料应用于生产，而且对于马尾松遗传转化体系、开展基因工程研究等具有重要意义。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容：1试验材料
供试材料为采自广东省信宜市林科所国家马尾松良种基地的混合家系种子以及福建漳平五一国有林场国家马尾松良种基地的马尾松无性系种子园内5个家系种子。
2试验方法
2.1外植体的处理
将成熟的马尾松球果放于1的氢氧化钠浸泡48h，并与烘箱内烘干，取出马尾松种子放在4℃冰箱内保存3-4周。
2.2马尾松成熟胚培养无菌体系的建立
将成熟马尾松种子带种壳浸泡过夜，并于流水下冲洗lh，马尾松成熟种子经过预处理剥去外种皮，在超净工作台上，用70%酒精消毒1min，在无菌水下进行三次冲洗，10%的84消毒液分别消毒3min，5min，7min，10min，无菌水冲洗三次，再用0.1%的升汞灭菌5min。用滤纸吸干残余水分，将胚乳切开，小心取出再把种胚接种在不添加激素的DCR培养基中。15d后观察死亡率、污染率，计算成活率。15d后没有萌动的种胚就认为死亡种子统计。
2.3马尾松成熟胚不定芽的诱导
马尾松不定芽诱导培养基选用DCR、LP、1/2MS、WPM四种培养基，激素组合以6-BA0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L四个水平和NAA0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L四个水平按L16（45）正交试验设计进行16个处理（见表1）,其中肌醇浓度0.1g/L，蔗糖浓度30g/L，琼脂浓度6g/L，PH值5.8。置于25l℃、光照(2000lx)16h/d下培养。30d后观察种胚在各培养基中不定芽诱导的生长情况，统计诱导率(表1)。
表1不定芽诱导的影响因子正交设计表
编号 | 培养基 | 6-BA（mg/L） | NAA（mg/L） |
1 | DCR | 0.5 | 0.05 |
2 | DCR | 1.0 | 0.1 |
3 | DCR | 2.0 | 0.2 |
4 | DCR | 3.0 | 0.0 |
5 | LP | 0.5 | 0.1 |
6 | LP | 1.0 | 0.2 |
7 | LP | 2.0 | 0.0 |
8 | LP | 3.0 | 0.05 |
9 | 1/2MS | 0.5 | 0.2 |
10 | 1/2MS | 1.0 | 0.0 |
11 | 1/2MS | 2.0 | 0.05 |
12 | 1/2MS | 3.0 | 0.1 |
13 | WPM | 0.5 | 0.0 |
14 | WPM | 1.0 | 0.05 |
15 | WPM | 2.0 | 0.1 |
16 | WPM | 3.0 | 0.2 |
2.3不定芽的增殖和伸长
为了研究不定芽增殖的影响因素，在蔗糖浓度、肌醇浓度及活性炭加入量三个方面做一个三因素三水平的一个正交设计（表2）。
表2不定芽增殖的影响因子正交设计表
试验水平 | 试验因素 | ||
蔗糖（g/L） | 肌醇（g/L） | 活性炭（g/L） | |
1 2 3 | 10 20 30 | 0.1 0.2 0.3 | 0 1 2 |
将在最佳培养基上培养4周后的不定芽接种到表3中的9种培养基上，观察不定芽的增殖和伸长，并做记录。
表3蔗糖、肌醇、活性炭对不定芽增殖的影响
编号 | 蔗糖（g/L） | 肌醇（g/L） | 活性炭（g/L） |
1 | 10 | 0.1 | 2 |
2 | 20 | 0.1 | 0 |
3 | 30 | 0.1 | 1 |
4 | 10 | 0.2 | 1 |
5 | 20 | 0.2 | 2 |
6 | 30 | 0.2 | 0 |
7 | 10 | 0.3 | 0 |
8 | 20 | 0.3 | 1 |
9 | 30 | 0.3 | 2 |
由于分化出的不定芽不能一直在原来的培养基上生长，在一定时间内需要转移到新鲜的培养基上，为了确定培养时间，需要进行对培养时间的试验（表4）。
表4培养时间对不定芽增殖的影响
编号 | 培养时间（周） | 继代个数（个） |
1 | 2 | 30 |
2 | 3 | 30 |
3 | 4 | 30 |
4 | 5 | 30 |
5 | 6 | 30 |
2.4不定芽的生根
用生长4周的生长较好的不定芽为试验材料，生根培养基以1/2DCR为基本培养基，其中肌醇浓度为0.1g/L、蔗糖浓度30g/L、琼脂浓度6g/L、PH值5.8。添加NAA、IBA、TDZ、KT这四种激素的不同配比研究对马尾松不定芽生根的影响（表5）。
表5不同激素组合对不定芽生根的影响
编号 | 激素组合 | |||
NAA（mg/L） | 6-BA（mg/L） | TDZ（mg/L） | KT （mg/L） | |
1 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.0 |
2 | 0.0 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
3 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
4 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.0 |
5 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.1 |
6 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.2 |
7 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 |
对照 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
3组培苗生产的成本分析
统计马尾松成熟胚诱导过程中不定芽的分化率、增殖率、不定根的诱导率以及移栽成活率，由此来分析马尾松快繁的效率以及快繁体系中单株试管苗生产所需的经济成本。
分化率=（产生不定芽的胚数/接种胚的总数）100%
增殖率=（不定芽的总数/产生不定芽的胚数）100%
不定根诱导率=（产生不定根的不定芽数/接种不定芽的总数）100%
移栽成活率=（成活株数/移栽的总株数）100%
单株苗成本=实验总成本/移栽成活株数
计划：
1实验进度安排
2015．12～2016．02查阅文献，形成初级实验方案。
2016．03～2016．05做毕设的实验。
2016．05～2016.06撰写及修改论文，准备答辩。
2经费预算
药品费：1000元
材料费：500元
打印费：500元
共计：2000元。
4. 研究创新点
马尾松良种主要以种子园和母树林的种子繁殖为主，传统的无性繁殖技术（扦插和嫁接）目前依旧不能满足造林的需要，制约了马尾松良种繁育的进程。利用组织培养的方法，能够为快速扩大繁殖马尾松良种提供了一条新途径，以较低的成本在较短的时间内将非实生苗大规模应用于生产。
