1. 研究目的与意义

紫楠(phoebe sheareri （hemsl.）gamble ), 又名紫金楠、金心楠、金丝楠，是樟科楠木属的常绿阔叶树。深根性树种,萌芽性强；生长较慢。树皮浅灰褐色, 纵裂；芽、嫩叶、幼枝、花序密被黄褐色绒毛。单叶互生,常集生于小枝顶端,倒卵形或倒卵状披针形,长10-22厘米,宽4-8厘米,先端突短尖或短渐尖,基部窄楔形,老叶表面秃净，亮绿色，仅沿中脉有毛，背面有毛，网状脉凸起。腋生圆锥花序。浆果卵状椭园形,蓝黑色,基部宿存花被瓣直立,果柄有毛。花期5-6月,果熟10- 11月。

紫楠产于我国江苏南部、安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、四川、贵州、广东、广西、云南省,分布面积甚广,一般不超过拔海l000米,在江苏境内不超过海拔450米。紫楠对气候的生态适应幅度大,是亚热带树种中较耐寒的树种。是耐阴树种, 多散生于海拔1000m以下常绿阔叶林中,或成小片纯林,喜潮湿环境,多生于山区沟谷、溪边,土层深厚之处。

紫楠是我国珍贵用材树种。木材心边材明显，边材淡灰色，心材淡褐色，纹理直，结构细，刨面光滑，心材径弦面具丝状光泽，金丝楠的雅号即可能据此而名。材质坚硬，花级美丽，是上等家具用材，又是建筑、造船和多种贵重木制器具良材。种仁可榨油,叶、材可提芳香油，出油率0.6-0.7%。树形挺秀，枝叶浓密，是很好的庭园树。具有很高经济价值和园林应用价值，是一种值得介绍引种推广而尚少栽培的树种。

2. 国内外研究现状分析

3.1 楠木属植物资源研究进展

3.1.1楠木属植物地理分布和分类学研究现状

楠木属是樟科经济价值较大的一个属，人们习惯将楠木属植物统称为楠木。楠木属植物为常绿乔木或灌木，叶互生，通常聚生枝梢，羽状脉；花小，两性或杂性，为腋生或顶生聚伞状圆锥花序或近总状花序；花被筒短，花被裂片6，相等或近相等，直立，宿存，花后变革质或木质；能育雄蕊9，排成三轮，第一、二轮的无腺体，花药内向，第三轮的基部或近基部有2个具柄或无柄腺体，花药外向，4室，室成对迭生；退化雄蕊3，位于最内轮，箭头形或心形，具柄；子房无柄，多为卵珠形或球形，花柱顶生，直或弯，柱头盘状或小而不明显；果为浆果状核果，基部为宿存花被片所包围；宿存花被片大都紧贴，少有松散或先端外倾；果梗不增粗或明显增粗。

据《中国树木志》(第1卷1983)记载，楠木属约有94种，分布于亚洲及热带美洲。我国约有34种3变种，产长江流域及以南地区，主产西南和华南，以云南、四川、湖北、贵州、广西、广东最多，多为珍贵用材树种^[1]。楠木属植物大多散生于海拔1000m以下的低山丘陵或沟边、溪旁，多喜欢阴湿的地理环境，为亚热带、热带常绿阔叶林的重要组成树种^[2]。其中许多树种木材优质，树型美观，利用开发潜力很大。

近年研究发现，虽然部分楠木属植物的现有分布范围很狭窄，但其潜在的分布范围却相当广泛。如闽楠的分布跨浙、鄂、湘、赣、川、黔，最南分布到两广和福建，最北可达安徽南部和河南。紫楠的分布范围也相当广泛，最南分布在中南半岛，最北可达江苏南部，现宜溧山区尚有野生林，与苦槠、青冈栎等混生。浙江楠的现有分布范围较为狭窄，成片分布仅见于浙江杭州云栖、理安寺，其余主要零星分布在江西、安徽和福建,多与壳斗科、木兰科、山茶科、冬青科、山矾科、野茉莉科和樟科常绿树种混生^[3]。

3. 研究的基本内容与计划

4.1 研究目标

（1）种子脱水耐性是判断种子贮藏特性的一个重要依据。通过实验，探索紫楠在自然脱水状况下的生理生化变化，为紫楠种子贮藏提供理论基础。

（2）通过对紫楠种子休眠原因从各方面进行不断探索，寻找出影响紫楠种子休眠的主要原因。

（3）鉴于紫楠种子休眠原因的基础上，通过试验，寻找出打破紫楠种子休眠的最有效的方法，以利于紫楠的大量栽植和推广。

4.2 研究内容

本试验主要研究紫楠种子的生物学特性、脱水耐性、种子休眠的原因及解除方法、在不同处理下种子生理生化的变化。主要研究内容具体如下：

（1）种子生物学特性研究：种子的基本形态测定

（2）种子脱水耐性研究：在自然脱水状态下，隔一段时间进行取样，对紫楠种子含水量、生活力、种子生理生化指标进行测定（相对导电率测定、过氧化物酶（POD）测定、超氧化物歧化酶（ SOD）活性测定、过氧化氢酶（CAT）活性的测定、超氧阴离子自由基（ O2-）含量测定、丙二醛（ MDA）含量测定、过氧化脂质（LOOH）含量测定）

4.3 拟解决的主要问题

（1）首次对紫楠的脱水耐性进行研究，需要注意控制好时间。

（2）试验样品数量大，因此需做好时间上及试验设计上的统筹安排工作，做到有条不紊。

(3) 有关打破楠木属种子萌发试验的研究不是很系统，可供参考的依据不足，在催芽试验中处理的各种浓度、时间等条件要不断摸索。

（4）对数学模型了解不够，实验中有较多数学模型的选择，及回归自变量的确定，需要不断的学习和了解。

5 课题研究的试验方案

5.1试验材料

紫楠种子采摘于苏洲穹窿山。

5.2试验地点料

南京林业大学生物技术大楼实验室

5.3试验设计与方法

5.3.1种子生物学特性

（1）用四分法取100粒种子，用游标卡尺分别测量种子的横径和纵径长度，精确到0.01mm。

（2）采用百粒法，即人工随机数取 8100 粒种子，使用 1/1000 电子天平分别称重，而后计算种子千粒重。

（3）用消毒的刀片剥去种皮，观察胚形态。

5.3.2种子脱水耐性的研究

精选大小均匀，无机械损伤的紫楠种子，均匀平铺于室内靠近窗户的台面上，自然晾干，每隔一个时间点（预试验），用四分法取一次样，测定含水量、生活力及各项生理生化指标测定。

5.3.2.1种子脱水与生活力测定

按照林木种子检验规程（ GB 2772-1999）关于含水量测定方法，测定种子的原始含水量。之后，将种子均匀平铺于实验室的平台上自然干燥。在干燥过程中，每间一个时间点（预实验）取 350 粒种子，测定种子生活力。同时，用间接推算法测定种子含水量。

① 含水量测定

即根据种子的原始含水量 G后，可根据种子在自然脱水之前的质量 M1与脱水之后的质量 M2，根据下面公式推算出种子的相对含水量：含水量（%）=[M2-M1（ 1-G） ]/M2

② 生活力测定

预处理：结合实际情况，制定紫楠种子生活力测定标准。

步骤：根据林木种子检验规程（GB 2772-1999）采用四唑测定法。随机抽取4 100 粒种子，用清水浸泡，使种子充分吸胀，用刀片将种子的种胚剥出。将剥出的种胚分别放在烧杯中，加入TTC 溶液，以浸没种子为度。将其放入35℃的恒温箱内保温，然后倾出药液，用自来水冲洗 2~3 次，将种胚摆在铺有湿滤纸的发芽皿中，观察种胚着色情况，判断种子有无生活力。根据染色结果，统计种子生活力。

判定方法：胚根及一半以上子叶被染成红色为有生活力种子。（如果未染部位延伸到了关键的形成层组织，就将影响胚根发展主根的能力，判为无生活力；若不染色部位仅仅限于根冠的软组织，不会影响胚根生长，归为活胚。）

5.3.2.2种子脱水各生理生化指标的测定

（1）相对电导率测定

参考韩建国等（2000）的方法。分别称取不同处理的种子约 2 g，先用清水冲洗三次，再用蒸馏水冲洗两次，然后用滤纸吸干浮水，放入 100mL 烧杯中，加入 50ml 蒸馏水，在 25℃浸泡后 (时间以种子吸胀为宜，一般4-8h)，结束后摇匀，采用 DS-11A（DDS-IIA）型电导率仪测定电导率（S1）；然后用塑料薄膜封瓶口，将浸泡液连同种子在沸水浴中煮 15min，摇匀，冷却至 25℃时测定其电导率（S2），以不加种子的双蒸水作对为空白对照，设三次重复。按下式计算相对电导率（L）：

相对电导率（L）=（S1空白电导值）/(S2-空白电导值) x 100%。

(2) 过氧化物酶（ POD）活性测定

① 酶液的制备：参考张志良和瞿伟菁（2003）的方法测定 POD 活性。称取种子材料 0.5g于研钵中，加入磷酸缓冲液（pH 6.0）1mL 研磨匀浆，加缓冲液使终体积为5ml。将提取液倒人离心管内,于l 0000r/min的冷冻离心机下离心15min,上清液即为超氧物歧化酶(SOD)粗提液。

②酶活性测定：在比色杯中加入反应混合液:（磷酸缓冲液（pH 6.0）50ml，愈创木酚 28μL，H₂O₂19μL）3ml，加入酶液 0.5ml（空白对照加入缓冲液 0.5ml），用美国 Beckman Coulter DU800 分光光度仪上测定 A470，每分钟读数一次，以每分钟吸光值变化表示 POD 活性（A470/ming-1FW）。

③计算：以每分钟内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位（u）。

过氧化物酶活性=A₄₇₀ V_T/ W V_S 0.01 t [u/(g.min)]

式中，A₄₇₀ 为反映时间内吸收光度的变化；W为紫楠种子重量，g；t 为反映时间，min；V_T为提取酶液总体积，mL；V_S 为测定时取用酶液体积，mL。

（3）超氧化物歧化酶（ SOD）活性测定

①酶液提取：参考高俊凤（2006）的方法测定 SOD 活性。称取种子材料 0.5g 于预冷的研钵中，加入 2ml预冷 提取介质（50mmolL-1磷酸缓冲液（pH 7.8）含量 1%PVP）在冰浴中研磨匀浆，转移至10mL量瓶中，用提取介质冲洗研钵23次(每次12mL)，合并冲洗液于量瓶中，定容至10mL。取5mL提取液于4℃下10000r／min离心15min，上清液即为SOD粗提液。

②SOD活性测定：取 7 支透明试管（3 支为测定管，3 支为光下对照，1 去为暗中对照），按下表加入反应显色试剂。

往 3 支测定管中加入粗提液 0.1ml 和蒸馏水 0.5ml，而光下对照和暗中对照仅加入蒸馏水 0.6 ml，其中暗中对照加完试剂后立即遮光，而其它试管置于 4000 lx 荧光灯显色反应 20 min（温度为 25℃），反应结束后遮光终止反应，用美国 Beckman Coulter DU800 分光光度仪测定 560 nm 的吸光度（以暗中对照管调零），并以下式计算 SOD 活性：

③计算

SOD 活性（ Ug-1FWmin-1）=(A₀-As) Vt 60 / A₀ 0.5 FW Vs t。

式中，A₀为光下对照管吸光度；As为样品测定管吸光度；Vt为样品提取液总体积（ml）；Vs为测定时粗酶液用量（ml）；t 为显色反应时间（min）；FW为样品鲜重（g）

（4）过氧化氢酶（CAT）活性的测定

① 酶液的提取：参考高俊凤（2006）的方法紫外吸收法测定CAT活性。称取种子材料 0.5g 于预冷的研钵中，加入 2ml预冷 提取介质（50mmolL-1磷酸缓冲液（pH 7.8）含量 1%PVP）在冰浴中研磨匀浆，转移至10mL量瓶中，用提取介质冲洗研钵23次(每次12mL)，合并冲洗液于量瓶中，定容至10mL。取5mL提取液于4℃下10000r／min离心15min，上清液即为酶粗提液，4℃下保存备用。

②CAT活性测定:取10mL具塞试管，加酶2ml提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。

取10mL试管4支，3支为测定（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：

将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后，逐管加入0.2mL200mmol. L-1 H₂O₂ 溶液，每加一管立即在紫外分光光度计上测定A₂₄₀(蒸馏水调零)，每隔30s读数一次，共测3min，记录4支试管的测定值。

③计算：以1min钟内A₂₄₀降低0.1（3支测定管的平均值）为一个酶活性单位（U），先求3支测定管各自1min内A₂₄₀降低值，按下式计算CAT活性。

式中，△A240=As₀ -（As₁ As₂ As_3）/3；As₀：煮死酶液对照管吸光度；As₁、As₂、As₃：样品测定管吸光度；V_T：酶提取液总体积(mL)；V_S：测定时取酶液的体积(mL)；FW：样品鲜重(g)。

（5）超氧阴离子自由基（ O^2-）含量测定

①标准曲线制作：取20ml，试管7支，编号，按下表顺序添加试剂，每加一种试剂摇动试管使之混匀：

加完试剂后将试管置30℃水浴中保温30min，显色反应后测定A₅₃₀，以NO₂^-浓度为横坐标，A₅₃₀值为纵坐标，绘制标准曲线。

②O^2-提取：按照高俊凤（2006）的方法测定O₂含量。取待测植物样品24g于研钵中，加适量65mmol．L-1磷酸缓冲液(pH7．8)研磨匀浆，定容10mL，四层纱布过滤，滤液经10000r／min离心10rain，取上清液备用。

③O^2-的测定：测定时取试管 3 支，各加样品提取液（上清液） 2 mL，磷酸缓冲液 1.5 mL，10 mmolL-1盐酸羟胺 0.5ml，如下表。混合后 25℃恒温水浴保温 20 min 后。

另取3支试管，如下表，从上述3支试管中各取反应液2．0mL，各加 17 mmolL-1对氨基苯磺酸 4 ml，7 mmolL-1α-萘胺 4 ml，于 30恒温水浴保温 30 min 后，用美国 Beckman Coulter DU800分光光度仪测定 A₅₃₀ nm 的吸光度，记录测定数据。

④ O ² 含量计算：O ² 含量（ μgg-1FW） =X Vt2 / FWVs.

式中，Vt为样品提取液的体积（ml）；2 为样品的稀释倍数；FW 为样品鲜重（g）；Vs为显色反应时取样品液的量（ml）。

（6）丙二醛（ MDA）含量测定

①步骤：参考高俊凤（2006）的方法测定 MDA 含量称取种子材料 0.3 g 于预冷的研钵中，加入 2 ml 0.05 molL-1磷酸缓冲液（pH 7.8）研磨匀浆后移至离心管中，再用 2 ml 缓冲液分 2 次冲洗研钵至离心管，向提取液中加入 5 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液并摇匀，然后将试管放入沸水浴中煮沸 10 min，结束后放入冷水浴中冷却，再用 3000 g 离心 15 min，取上清液并量其体积。用美国 Beckman CoulterDU800 分光光度仪以 0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测定 532 nm、 600 nm 和652 nm 的吸光度。

②MDA 含量计算：

MDA 含量（ mmolg-1FW）=[6.452（ A₅₃₂-A₆₀₀）-0.559A₄₅₀] Vt/（ VsFW）

式中，Vt为样品提取液的体积（ml）； Vs为显色反应时取样品液的量（ml）。

4. 研究创新点

紫楠是我国珍贵用材树种。木材心边材明显，边材淡灰色，心材淡褐色，纹理直，结构细，刨面光滑，心材径弦面具丝状光泽，金丝楠的雅号即可能据此而名。材质坚硬，花级美丽，是上等家具用材，又是建筑、造船和多种贵重木制器具良材。种仁可榨油,叶、材可提芳香油，出油率0.6-0.7%。树形挺秀，枝叶浓密，是很好的庭园树。具有很高经济价值和园林应用价值，是一种值得介绍引种推广而尚少栽培的树种。

但目前紫楠在国内还没得到广泛种植和推广，关于紫楠报道也很少，仅在引种栽培、育苗试验、培育技术方面有一些研究。关于紫楠种子脱水耐性和休眠机理至今未有报道。因此，研究紫楠种子脱水耐性和休眠机理及解除方法对其在园林中的应用推广有重要意义。