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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
选题的依据及意义
葡萄是全球性重要果树之一，是世界上加工深度最高、加工产品最丰富的浆果类水果。葡萄果实发育过程就是果实大小，色泽，风味，质地等品质形状形成的过程。色泽是葡萄浆果外观品质的重要组成部分，它不仅决定鲜食葡萄市场价值，而且影响其加工用途与加工品的质量。随着不同葡萄品种间的杂交以及人工选择，如今葡萄果皮颜色的种类变得越来越丰富。葡萄果皮颜色基本上分为3种，黑色，红色和黄绿色。其中，黑色和红色品种是由于花色苷在果皮中的积累造成的，花色苷在果皮中积累的数量差异以及不同花色苷的复合造成我们所见到的葡萄的各种颜色［1］。一方面，果实着色程度是判断成熟度及品质的重要指标，另一方面，对于酿酒葡萄，色素含量会直接影响葡萄酒和葡萄汁的色泽与质量。果实色泽是决定果实商品价值的重要指标之一。有关葡萄分子生物学的研究发展迅速，其中在有关矮化突变，着色机理和基因组测序等研究方面取得重要的研究成果。由于葡萄的色泽对葡萄的加工用途，市场效益，经济价值具有重要的影响，所以对葡萄花色苷的生物合成以及果实着色机理的研究具有重要的意义。
国内外研究概况及发展趋势
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
本研究希望利用控制葡萄果实色泽性状myb基因的基因型与单倍型的特点，预测不同亲本组合后代群体着色类型以及分离比例，开发出实用的果实色泽性状分子设计育种新技术。进一步基于葡萄果实的糖、酸、果形、香味等数量性状的遗传特点，研究并提出优先考虑糖酸、果形、果粒大小等指标进行候选亲本选择，再利用控制果实色泽性状的myb基因信息缩小育种亲本范围，筛选出最理想的育种亲本材料的育种新措施，同时该措施可对杂交后代群体进行早期
选择与淘汰，使得后代群体中满足育种目标或是接近育种目标的优株比例大大提升，达到缩短育种年限以及提高育种效率的目的。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
通过CTAB方法提取葡萄叶片的DNA,设计六对特异性引物，对DNA进行特异性扩增，得到葡萄单倍型基因，进行琼脂胶电泳，进而根据跑胶条带分析葡萄的单倍型，从而判断葡萄果实的色泽。
技术路线：
实验方案：
1. 采集葡萄叶片：32个优良葡萄品种均采自中国农业科学院郑州果树所
| 品种 Cultivar | 果皮颜色 Skin color | 种名 Species | 亲本 Parents |
| 巨玫瑰 | 紫黑色 | 欧美杂种 | 沈阳玫瑰（4N）×巨峰 |
| 泽香 | 黄绿色 | 欧亚种 | 玫瑰香葡萄×龙眼葡萄 |
| 奥古斯特 | 黄绿色 | 欧亚种 | 意大利×葡萄园皇后 |
| 醉金香 | 黄绿色 | 欧美杂种 | 沈阳玫瑰♀×巨峰♂ |
| 泽玉 | 绿黄色 | 欧亚种 | 玫瑰香×龙眼 |
| 翡翠玫瑰 | 黄绿色 | 欧美杂种 | 红香蕉×葡萄园皇后 |
| 贵妃玫瑰 | 绿黄色 | 欧美杂种 | 红香蕉♀×葡萄园皇后♂ |
| 脆玉 | 黄绿色 | 欧亚种 | 玫瑰香×京早晶 |
| 京玉 | 绿黄色 | 欧亚种 | 意大利×葡萄园皇后 |
| 郑州早玉 | 绿黄色 | 欧亚种 | 葡萄园皇后×意大利 |
| 内京香 | 绿黄色 | 欧美杂种 | 白香蕉×京早晶 |
| 碧香无核 | 黄绿色 | 欧亚种 | 早玉（1851）×莎巴珍珠 |
| 翠峰 | 黄绿色 | 欧美杂种 | 先锋×森田尼无核 |
| 早金香 | 黄绿色 | 欧亚种 | 玫瑰香×莎巴珍珠 |
| 红瑞宝 | 紫黑色 | 欧美杂种 | 金玫瑰×黑潮 |
| 夕阳红 | 紫红色 | 欧美杂种 | 7601(玫瑰香芽变)×巨峰 |
| 瑰香怡 | 紫黑色 | 欧美杂种 | 7601(玫瑰香芽变)×巨峰 |
| 龙宝 | 粉红色 | 欧美杂种 | 金玫瑰×黑潮 |
| 香槟 | 蓝黑色 | 美洲种 | 康可×哈佛德 |
| 红富士 | 粉红色 | 欧美杂种 | 金玫瑰×黑潮 |
| 金田红 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×红地球 |
| 紫珍珠 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×莎巴珍珠 |
| 济南早红 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×葡萄园皇后 |
| 状元红 | 紫红色 | 欧美杂种 | 巨峰×瑰香怡 |
| 早玫瑰 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×莎巴珍珠 |
| 爱神玫瑰 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×京早晶 |
| 红双味 | 紫红色 | 欧美杂种 | 葡萄园皇后×红香蕉 |
| 郑州早红 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×莎巴珍珠 |
| 园意红 | 鲜红到紫红色 | 欧亚种 | 红地球×意大利 |
| 红莲子 | 紫红色 | 欧亚种 | 玫瑰香×葡萄园皇后 |
| 早黑宝 | 紫黑色 | 欧亚种 | 瑰宝（母本）×早玫瑰（父本）
|
2.PCR特异性引物的合成
F0：GATTCTGGTGATGGTGTGAGT
R0:GACAATTTCCCGTTCAGCAGT
F1: AAAAAGGGGGGCAATGTAGGGACCC
R1:GAACCTCCTTTTTGAAGTGGTGACT
F2:GGACGTTAAAAAATGGTTGCACGTG
F3:CACCACTTGAAAAAGAAGGTC
R3: TCTTGATCCAGCTCAGCTAAC
F4: GCTGAGCATGCTCAAATGGAT
R4: TCCCACCATATGATGTCACCC
F5: GAAGGAGCCGGTCTCTTGTG
R5:GTGTTTGCATCCACTGCTCA
3.配DNA提取试剂
| DNA提取试剂的配剂 | 200ml | |
| ② | 0.1mol Tris | 2.428g |
| 2% CTAB | 4g | |
| 1.4mol NaCl(58.44) | 16.4g | |
| 20mol EDTA( 92.248) | 1.16g | |
| ③ | 5mol KAc(乙酸钾98.14) | 38.14g |
| ④ | 10mol LiCl（氯化锂42.39) | 84.28g |
4.DNA的提取方法
CTAB法提取DNA的步骤：
（1）准备2 mL离心管，121℃灭菌20min，在烘箱中将管子烘干备用；用锡纸包好研钵、研棒和勺子，烘箱中200℃烘4-6 h，取出烘好的研钵等冷凉待用；
（2）打开水浴锅，设置为55℃；
（3）拿出2 mL离心管，磨样，当样品为叶子时，每管加1 mL 的试剂②，和20 μL β-巯基乙醇（2%），以及约0.2 g磨好的样品；在55℃水浴锅中放置20 min，每隔10min轻轻翻转几下；
（5）每管加100 μL试剂③、100μL乙醇、600μL氯仿，漩涡仪混匀1min30s-3min，4℃，10000 rpm，离心10 min；
（6）吸取上清900μL液到新的管子，加等体积的900μL氯仿，漩涡30s，4℃，10000 rpm，离心10 min；
（7）换用1.5mL离心管，取上清600μL，200μL④，480μL异丙醇，15 μLβ-巯基乙醇，-20℃冰箱放置2-4 h（-40℃，2h）；
（8）2-4 h 后10000 rpm，离心10min；去除上清液，加入750μL -20℃预冷的乙醇和250μL的DEPC处理水，需弹开，10000 rpm，离心7min；
（9）去上清液，纸上吸水，加入750μL的无水乙醇，弹开，10000rpm，离心7 min，纸上放置=10min，将沉淀在通风橱上晾干；每管加15-20μL的DEPC水溶解沉淀，弹开，离心，获得总DNA。-20℃保存。
电泳及分光光度计检测DNA质量，采用核酸蛋白测定仪（Eppendorf公司生产）检测浓度后稀释到50ng·μL-1，-20℃冰箱保存备用。
5.PCR扩增
以葡萄DNA片段为模板，使用引物进行荧光定量PCR扩增反，应体系如下：
| ddH2O | 8.5μL |
| 上游引物（F） | 1 μL |
| 下游引物(R) | 1 μL |
| DNA片段 | 2.0 μL |
| Mix | 12.5μL |
| 总体积 | 25 μL |
可行性分析：
本实验充分利用中国农业科学院郑州果树所的葡萄种质资源圃中丰富的葡萄种质资源，对目前市场上畅销的三十种葡萄品种进行父母本关于Myb基因单倍型的验证。另外，实验室在江苏省农业科学院溧水基地，选择优良的杂交组合结构，在开花期前进行去雄授粉处理，第二年将授粉得到的种子播种，在幼叶期采集叶片对幼苗的果实色泽进行预测，后期进行果实拍照验证。
实验利用自交或杂交群体亲本以及后代单株的MybA1和MybA2基因位点的基因型和单倍型的鉴定结果来验证“基于葡萄Myb基因型与单倍型调控果实着色的特点，预测不同亲本组合的后代群体着色类型以及分离比例的规律”。本研究希望利用控制葡萄果实色泽性状Myb基因的基因型与单倍型的特点，预测不同亲本组合后代群体着色类型以及分离比例，开发出实用的果实色泽性状分子设计育种。4. 研究创新点
特色或创新之处
有实验研究发现具有不同单倍型葡萄品种的果皮中的花色苷含量及组成也不同。MybA1和MybA2基因位点上的基因型构成的单倍型的多样性，决定了葡萄果皮色泽的不同。不同葡萄品种MybA1位点的4种等位基因与MybA2位点的4种等位基因在不同品种中形成了多种单倍型组成。迄今对部分欧亚种葡萄和欧美杂种葡萄品种的研究已经发现8种调控葡萄果皮着色的单倍型。随着自然杂交和人工选择以及对对更多葡萄品种的研究，还有可能发现其它的单倍型类以及可能的单倍型组合情况，它们对葡萄果皮着色有着不同的影响，这是葡萄色泽多样性的重要遗传基础。本实验通过设计特异性引物鉴定不同葡萄品种的Myb基因的不同单倍型，从而在分子水平上可以预测出果实色泽，在葡萄苗初期就可以将我们不需要或者色泽不符合要求的幼苗淘汰掉。从而达到精准种植的目的。
5. 研究计划与进展
研究计划
葡萄叶片的采集
叶片dna的获取
