细胞壁发育与番茄裂果的关系开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

1.课题的意义和应用前景

裂果是果实类园艺作物生产上亟待解决的重要问题，如番茄、樱桃、葡萄、苹果、石榴、香蕉等果实都存在着严重的裂果现象。果实产生裂痕后，会影响外观品质，缩短货架期，甚至会感染霉菌，使果实降低或失去商品价值，给生产造成严重的经济损失。番茄（lycopersicon esculentum Mill）是全球最重要的蔬菜作物之一，也是公认的研究果实发育和成熟的模式植物，商业价值高，栽培范围广泛，鲜食和加工应用普遍，但存在严重的裂果现象。据联合国粮农组织2012年统计，中国番茄栽培面积居世界首位，年产量为5000万吨左右，约占世界番茄总产量的四分之一。

裂果的原因分为内因和外因两个方面，品种内因（果实遗传、形状、大小、硬度、果皮强度、解剖结构、组成成分、果皮气孔数渗透势、果肉吸水能力、果实生长时期等）和外因如栽培管理（灌溉、营养等）、环境（湿度、温度、风、光等）均会影响番茄裂果。果实本身遗传特性、组织器官结构和生理生化因素等内部因素对果实是否裂果有至关重要的作用，但果园栽培条件和管理措施以及气候条件等外界因素同样影响很大。番茄裂果的直接原因是由于吸水过多，从而引起薄壁组织细胞膨胀，导致果皮的机械性破坏^[1]。番茄的裂果常发生在转色期和红熟期。果实成熟过程中，活性氧代谢失调，组织老化，细胞壁逐渐降解，裂果率也会逐渐增加。春播番茄在果实发育后期常遇夏季高温和暴雨（特别是持续的降雨）等天气，导致土壤水分急剧变化，极易出现裂果现象，易裂果品种的裂果率可达90%以上。

果皮的强度、弹性和塑性是影响果实开裂的重要因素，果皮生长发育涉及到细胞分裂和随之而发生的细胞增大两个过程的结合。细胞分裂和细胞增大均涉及细胞壁的合成和构建。在细胞膨大过程中，细胞壁一方面发生部分壁结构分解，与松弛有关；另一方面不断有壁成分的合成，以满足壁面积的扩大^[2]。细胞壁的机械性能控制着细胞生长与否，以及生长的速度^[3]。这些细胞壁成分和壁成分之间的化学键构成了细胞壁机械性能以及果皮强度的物质基础。细胞壁是位于组胞膜外的一层较厚、较坚韧并略具弹性的结构，不仅是一个机械的支架，而且更重要的是一个有代谢活动的结构。主要由多糖（果胶质、纤维素和半纤维素）、蛋白质（酶、结构蛋白和凝集素）、简单和复杂酚类物质以及化学元素钙、硼、硅等构成，细胞壁各组分间通过共价键、离子键、氢键、疏水相互作用和随机填充联系在一起^[4,5]。

细胞壁的降解是由相关酶类的作用下逐渐进行的。与细胞壁相关的酶类有２种，细胞壁水解酶和细胞壁氧化酶。其中水解酶主要包括果胶酶、果胶甲酯酶以及纤维素酶，氧化酶包括POD、PPO。而水解酶是通过降解细胞壁组成成分而使果皮的强度下降；

氧化酶是通过是使细胞壁各成分之间酚基交联而使果皮的延伸性下降。

目前，对于裂果生理及裂果的防控己经进行了一些研究，通过设置物理屏障、喷施化学药剂（钙、GA_３等）、优化栽培管理（合理肥水、修剪等）、筛选耐裂品种及砧木等措施进行裂果的防控，取得了一定成效，但处理时期及地点等的改变会影响裂果的防治效果，还没有稳定有效地防控方法，要从根本上解决这一问题，培育耐裂果品种是重要途径。裂果的机制还不明确，而探明裂果的机理，进而指导耐裂果新品种选育有重要的理论与实践意义。

2.国内外研究概况

自1930年以来，国内外科研人员针对裂果现象做了大量的研究，发现裂果与果实内含物的息息相关。在果实成熟的过程中，内部代谢情况随之改变。内源激素对于果实的发育起到至关重要的作用，李建国和黄辉白^[9]研究发现，裂果果实种子中内源性GA 含量显著高于正常果实,丁改秀等^［10］进一步研究发现，GA_３可以有效地降低细胞壁相关水解酶的活性，最终会影响到果皮原果胶以及纤维素的含量，从而增强果皮破裂应力，降低了壶瓶枣果实裂果率。在生产方面，Jason^[8]研究发现，喷施赤霉素的水溶液可以降低裂果。除此之外，矿质元素可以改变果实果皮果胶结构以及果胶酶的活性，因此也与裂果密切相关，元素之间相互作用，共同影响了裂果的发生。汝学娟等^［11］研究表明喷施钙肥和钾肥可显著降低番茄裂果，原因在于番茄偏喜钾肥，在充足的钾肥作用下，可以使果皮变厚，从而能减少裂果的发生。杨俊强^［12］等研究发现，因为Mg和Ca元素的吸收存在着明显的拮抗作用，当Mg元素含量过多时或许会导致植株对Ca元素吸收不足，从而增加了裂果的发生。随着果实的逐渐成熟，糖的含量也在发生变化，1938年Tucker^[6]研究发现，栽培品种的糖含量与品种的开裂倾向之间具有相关性。Considine^[7]进一步研究表明，果实成熟时，果实内会积累大量糖类物质，当果实水势升高时容易导致果实裂果。

3.参考文献

[1]HuangXM,WangHC,ZhongWL,YuanWQ,LuJM,LiJG.Sprayingcalciumisnotaneffectivewaytoincreasestructuralcalciuminlitchipericarp.ScientiaHorticulture,2008,117:39-44.

[2]黄祥辉．植物细胞的延长生长[J]．植物生理学通讯，1984（2）：6-11.[3]Cosgrove D J.Wall extensiblity:its nature,measurement and relationship to plant growth[J]． New Phytologists,1993,124：1-23.

[4]CosgroveDJ.Growthoftheplantcellwall[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2005,6(11):850-861[5]赵云峰,林瑜,林河通.细胞壁组分变化与果实成熟软化的关系研究进展[J].食品科技,2012,37(12):29-33.

[6]Tucker R.A varietal study of the susceptibility of sweet cherries to cracking[J]，University of Idaho Agriculture Experimental Station Bulletin,1934,211:1-15.

[7]Considine J.Physical aspects of fruit growth:cuticular fracture and fracture pattems in relation to fruit structure in Vitis vinifera[J].Journal of Horticultural Science,1982,57:79-91.

[8]Jason JS Sandhu A S,Zora Effect of plant growth regulators sparys on the endogenous level of phytohormones and splitting of lemon fruit[J].Recent Horticultural,1998,4:19-21.

[9]李建国，黄辉白．荔枝裂果研究进展［Ｊ］．果树科学，1996，13(4)：257-261.

[10]王保明，丁改秀，王小原，等．枣果实裂果的组织结构及水势变化的原因［Ｊ］．中国农业科学，2013,46(21):4558-4568.

[11]汝学娟，郑阳，杨琦凤，等．矿质元素致番茄裂果的影响机理研究［Ｊ］．西南农业学报，2014，27(1):259-262.

［12］杨俊强，王宝明，王小原．枣裂果研究进展［Ｊ］？山西农业科学，2009，37(3)：86-89.

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1.研究方法

实验一 裂果率测定

定植后两个月左右分别调查绿熟期、转色期及红熟期的总果数和裂果数。调查方法为每个重复随机选取10株番茄植株，统计每株番茄不同时期的总果数及裂果数，将10株番茄植株果实的总和记为该重复的统计值。

不同时期裂果率（％）＝（本时期裂果数／本时期总果数）x100％

取绿熟期、转色期和红熟期番茄果实，将果实按照1:2:1比例分为上部（近果柄端）、中部和下部（远果柄端），取果实称取样品测定下列指标，下同。

实验二 细胞壁物质提取

参照Rose^[1]的方法略有改动。将番茄果实称取10g。番茄用液氮研磨成粉，放于100ｍＬ煮沸的95％乙醇中，煮沸1h。煮沸后使用玻璃纤维过滤器过滤，之后依次使用100ｍＬ95%乙醇、100ml氯仿：甲醇（1:1V/V）、100mL丙酮过滤，将残渣置于烘箱37℃烘置恒重，此即为番茄果皮的细胞壁成分，密封保存。

(1)水溶性果胶的提取

称取细胞壁物质0.1ｇ,５次重复。加入10ml蒸馏水置于摇床上，28℃振荡提取12ｈ。3500rpm离心30min，使用玻璃纤维过滤器过滤，收集上清液。再向沉淀物中加入４mL蒸馏水，3500rpm离心10min，使用玻璃纤维过滤器过滤，收集上清液。合并２次上清液。

(2)CDTA溶性果胶的提取

将蒸馏水换成50ｍＭCDTA，使用水溶性果胶的提取剩余物，参照水溶性果胶的提取方法。

(3)Ｎa_２CO_３溶性果胶的提取

将蒸馏水换成50mＭＮa_２CO_３（包含20ｍＭNaBH_４），使用CDTA溶性果胶的提取剩余物，参照水溶性果胶的提取方法。

(4)4%KOH可溶性半纤维素的提取

将蒸馏水换成4％KOH包括0.1%NaBH₄，使用Na_２CO_３溶性果胶的提取剩余物，参照水溶性果胶的提取方法。

(5)24%KOH可溶性半纤维素的提取

将蒸馏水换成24%KOH，使用4%KOH可溶性半纤维素的提取剩余物，参照水溶性果胶的提取方法。

(6)α-纤维素的的提取

将上述提取剩余物分别用丙酮洗涤37℃烘至恒重。

实验三 细胞壁物质含量测定

（1）果胶含量的测定

参照曹建康等^［2］方法，吸取ｌmL提取液，沿管壁小心地加入６mL浓硫酸，在沸水浴中加热20min，取出冷却至室温后，加入0.2mL1.5ｇ／Ｌ咔唑－乙醇溶液，摇匀。在暗处放置30min后，测定反应液在波长530ｎｍ处的吸光度值。

(2)纤维素和半纤维素含量测定

参照郑炳松^［3］方法，取提取好的纤维素和半纤维素溶液2ｍＬ于15ｍＬ离心管中，加入0.5ｍＬ2％蒽酮试剂，之后并沿管壁加入5ｍＬ浓硫酸，摇匀，静置12min，然后再620nm波长下测其吸光度

实验四 细胞壁相关酶活性测定

(1)PPO活性测定

称取1g果蔬组织样品，置于研钵中，加入1.6ｍＬ提取缓冲液，在冰浴条件下研磨，4℃、12000Ｘg离心30min，收集上清液即为提取缓冲液，低温保存。取一支15mL离心管，加入4mL50mmol／Ｌ、pH5.5的乙酸－乙酸钠缓冲液和１mL 50mmol／Ｌ邻苯二酚溶液，最后加入0.1mL酶提取液。测定波长在420nm处吸光度变化值。

(2) PG活性测定

参照曹建康等^［2］方法，称取1g番茄样品，放置于预冷的研钵中，加入预冷的95%乙醇10ｍＬ，研磨成匀浆后，将匀浆转入到15ｍＬ离心管中，低温条件下放置10min，然后于４℃、12000xg离心20min。移出上清液，向不溶物中再加入经预冷的80%乙醇10mL，上下振荡，低温条件下放置10min，然后在同样的条件下离心。

再移出上清液，将预冷的提取缓冲液加入到沉淀物中，于４℃放置提取20min，再经过离心后收集上清液即为酶提取液，４℃保存备用。

取２支15ｍＬ离心管，每支试管中都分别加入1ｍＬ50mmol／Ｌ、pH5.5乙酸－乙酸钠缓冲液和0.5mL10ｇ／Ｌ多聚半乳糖醛酸溶液。向样品管中加入0.35mL酶提取液，对照管中加入经过煮沸的0.5mL酶提取液。混匀后在37℃条件下保温1h。之后，每个离心管中加入105mL3,5－二硝基水杨酸试剂，沸水浴条件下加热5min。冷却至室温后，于波长540nm测定吸光值。

(3)Cx活性的测定

参照曹建康等^[2]方法，酶提取液提取同PG活性。取２支15ｍＬ离心管，分别加入1.5ｍＬ10ｇ／ＬCMC溶液。向样品管中加入0.5ｍＬ酶提取液，对照管中加入经过煮沸的0.5ｍＬ酶提取液。混匀后在37℃条件下保温ｌｈ。之后，每个离心管中加入1.5mL3,5－二硝基水杨酸试剂，沸水浴条件下加热5min。冷却至室温后，于波长540nm测定吸光值。

(4)β－葡萄糖苷酶活性测定

参照曹建康等^[2]方法，取２支15ｍＬ离心管，分别加入1.5ｍＬ10ｇ／Ｌ水杨苷溶液。向样品管中加入0.5ｍＬ酶提取液，对照管中加入经过煮沸的0.5ｍＬ酶提取液。混匀后在37℃条件下保温1h。之后，每个离心管中加入1.5ｍL3,5－二硝基水杨酸试剂，沸水浴条件下加热5min。冷却至室温后，于波长540nm测定吸光值。

数据分析

利用Excel.2010和IBM SPSSStatistics21.0软件进行数据处理与分析。