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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
梨（pyrus）是蔷薇科（rosaceae）桃亚科（amygdaloideae）梨属（pymy l.）的多年生木本植物，是世界上重要的落叶果树之一[1]。我国梨资源丰富，有三千多年的栽培历史，栽培面积和产量一直居世界首位，但是市场竞争力较弱、出口量较少，主要原因是我国梨果品质较差，肉质粗糙。因此，我们需要提升中国梨果品质，而石细胞是影响梨果实品质的重要因素。
石细胞是梨果实组织中一类常见的厚壁组织细胞，具有增厚的次生细胞壁，由薄壁细胞在细胞壁二次沉积木质素、纤维素等成分发育而来[2-3]。梨果肉中的石细胞直接影响着果肉的粗细，石细胞含量高，肉质粗糙，果实品质降低。因此，降低石细胞含量对改善梨的品质至关重要[4]。而有研究表明梨果肉石细胞的形成与木质素的生物合成、转运、沉积有密切的关系，所以我们可以通过调控木质素代谢，影响梨果实中石细胞的形成，从而降低梨果实中的石细胞含量，提高梨果实品质[5]。
nac转录因子基因家族成员数量非常多，并且参与植物体许多生命活动，例如花发育[6]、分生组织发育[7]、根系的发育[8]、对生物和非生物胁迫应答[9-10]等。其中，z567是第一个被发现参与次生细胞壁形成的nac转录因子。之后，又从拟南芥中发现了与z567具有高度序列相似性的7种nac转录因子，将这7条nac基因编码的蛋白分别命名为vnd1-vnd7，根据vnd6和vnd7只在导管细胞中特异表达的特点，发现抑制vnd6和vnd7的表达后会造成导管细胞的次生壁不能正常加厚[11]。拟南芥中，与vnd具有高度序列相似性的nst1、nst2、nst3（snd1）转录因子也可调节除木质部以外其他细胞次生细胞壁的形成，其中nac转录因子（snd1）的直接转录靶标atmyb103可以调控s-木质素的生物合成[12-14]。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
本研究将过量基因表达载体pcambia1301-pbrnac，使用农杆菌介导的遗传转化方法转化模式植物拟南芥，得到转基因阳性植物。通过对阳性植株生理性状及木质素合成基因表达量的分析，显微镜观察转基因拟南芥茎组织，验证其是否能调控木质素代谢，从而利用pbrnac1在梨果实石细胞和木质素合成过程中的作用，降低石细胞含量，提高品质。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法及方案
1.1 试验材料
本研究选择白梨系统中的砀山酥梨（P. bretschneideri）作为研究材料，其果肉石细胞含量较多且肉质粗糙。在江苏省高邮果园采收花后21、35、49、63、77、91、105和150天的果实样品。果实样品需大小均匀，成熟度相对一致，且无病虫害、机械损失。每个时期样品采自3棵不同的树，分开收集作为3次生物学重复。用于RNA和DNA提取的样品用液氮速冻处理后，需保存在-80℃超低温冰箱中；剩余样品放在4℃冷库中保存。
1.2RNA和DNA提取
总RNA和DNA的提取采用CTAB法，并通过分光光度计和跑琼脂糖胶检测提取样品的质量。
1.3 PbrNAC1的克隆和生物信息学分析
取3 μg砀山酥梨早期果肉RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesiskit（Transgen, China）进行反转录，表1为引物信息。PCR产物经过胶纯化回收，连接到pEasy（Transgen, China）中间载体转化到大肠杆菌菌株DH5α中，挑取至少5个单独的克隆用于测序。
表 1 PbrNAC1克隆引物
Table 1 Primers for cloning PbrNAC1
| 基因缩写Abbreviation | 正向引物Forward (5' to 3') | 反向引物Reverse (5' to 3') |
| PbrNAC1 | tctagaATGTCTGATGATCAAATGAGTCTATCAA | ggatccCACCGACAAGTGGCAAAG |
注：小写字母为酶切位点。
PbrNAC1编码的氨基酸序列与其他物种已知功能的NAC转录因子通过ClustalW软件比对。通过MEGA的Neighbor–Joining方法构建进化树，枝的可靠性用bootstrap检测重复1000次。Expert Protein Analysis System(http://web.expasy.org/compute_pi/)用于预测PbrNAC1的等电点和和蛋白的分子量大小。
1.4pCAMBIA1301-PbrNAC表达载体的构建
以目的基因载体质粒DNA为模板进行扩增，回收扩增产物并在大肠杆菌中遗传转化，选取阳性克隆测序结果与目的基因相同的阳性克隆载体质粒与pCAMBIA1301空白载体质粒双酶切，用T4连接酶链接并在大肠杆菌中遗传转化，选取阳性克隆测序并选择与目的基因序列相同的阳性克隆。
1.5PbrNAC亚细胞定位
PbrNAC1的CDS序列全长构建到GFP上游，形成35S-PbrNAC1-GFP融合表达载体。采用冻融法将测序验证正确的质粒和对照质粒（35S-GFP）转入农杆菌菌株GV3101中。载体通过农杆菌介导的转化法转入到烟草表皮细胞中，方法如下：
1、用含有50 mg/L K 和100 mg/L R 的固体LB培养基划线活化农杆菌，在28℃的培养箱中培养36小时；
2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100 mL锥形瓶中，加入30mL含有50 mg/L K 和100 mg/L R 的液体LB培养基，在28℃的摇床中200 rpm培养12小时；
3、用10 mL离心管4000 rpm离心20分钟收集两次菌体；
4、每个离心管中加入2 mL诱导介质（10 mM MgCl2、10 mM MES、200 mM乙酰丁香酮，pH 5.6）重悬后，在小摇床上60 rpm室温诱导3个小时；
5、用去掉针头的注射器将诱导好的液体注射到烟草叶片的背面，放到25℃的培养室，16小时光照/8小时黑暗，培养3-4天。
取1 cm2大小的烟草叶片，用DAPI染色，配方见表2。DAPI能够与DNA强力结合，用紫外光波长的光线激发后，散发光呈蓝色，用于荧光显微镜中定位细胞核。用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察样品，不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。
表2 DAPI试剂
Table 2 DAPI reagent
| 试剂名称 | 终浓度 |
| Tris | 100mM |
| NaCl | 150mM |
| CaCl2 | 1mM |
| MgCl2 | 0.5mM |
| NonidetP40 | 0.10% |
| DAPI | 1μg/mL |
注：用HCl调pH到7.4
1.6 基因表达量分析
取3 μg的RNA使用SYBR PrimeScriptmiRNA RT-PCR Kit（Takara, Japan）进行第一链cDNA的合成。实时荧光定量PCR使用的是LightCycler 480（Roche, USA）。设三次生物重复和三次技术重复。基因的相对表达量用2-ΔΔCp算法计算。PbrNAC1过量表达拟南芥T2代阳性株系，种子发芽后10天的幼苗提取RNA后，用于分析木质素合成代谢相关基因的相对表达量变化。
1.7 拟南芥转化及生物量测定
用含有PbrNAC1过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染Col-0拟南芥。具体方法如下：
1、用含有50 mg/L K 和100 mg/L R 的固体LB培养基划线活化农杆菌，在28℃的培养箱中培养36小时；
2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100 mL锥形瓶中，加入30 mL含有50 mg/L K 和100 mg/L R 的液体LB培养基，在28℃的摇床中200 rpm培养12小时；
3、用50 mL离心管5000 rpm离心20分钟收集菌体；
4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2 MS；5%蔗糖（W/V）；10 μg/L 6-BA；用KOH调pH到5.7；0.025%表面活性剂（V/V）】中；
5、将待转化的拟南芥剪去角果和已开放的花；
6、把拟南芥花序浸泡在含有菌体的转化介质中，用真空抽滤泵抽真空到380 mm汞柱，浸泡5分钟；
7、放置在22℃的培养室中避光24小时，之后放在22℃、长日照（16小时光照/8小时黑暗）条件下培养。
两周大的拟南芥T1代阳性植株，取花序茎杆提取RNA后，用半定量检测PbrNAC1表达量。选择有较高的表达量株系的纯合子用于后续实验。T2代纯合子种子与野生型种子消毒后，一起播到发芽培养基【MS；3%蔗糖（W/V）；0.75%琼脂（W/V）】上。之后将幼苗种到营养土中，于22℃、长日照（16小时光照/8小时黑暗）条件下培养。发芽后每个株系随机选取8株，观察植株生长并记录。
1.8 转基因拟南芥木质素的分析
野生型和T3代转基因系各取15株，收集花序茎下部10cm长的茎，切成2mm长度，并混合样品烘干至恒重。取5 mg干燥过后的样品提取CWR（细胞壁残渣）用于木质素分析，步骤如下：样品放在2 mL离心管中，用水（98℃）、乙醇（76℃）、氯仿（59℃）、丙酮（54℃）各处理30分钟，最后干燥至恒重。采用溴乙酰可溶木质素测定法测定木质素含量。木质素组成成分用thioacidolysis法测定。木质素经过thioacidolysis作用形成的派生物用三甲基硅烷衍生化后，用GC-MS检测。试验重复四次，每次样品用量均相同。1.9 转基因拟南芥茎组织显微镜观察
1.9.1 石蜡切片
在拟南芥发芽后8周，随机选取T3代转基因系和野生型植株各五株，取第二节间样品用FAA固定液在4℃固定一周时间以上，经过以下步骤制作石蜡切片：
1、脱水：依次用85%、95%、100%、100%乙醇脱水2小时，再用体积比为1：1的无水乙醇和二甲苯脱乙醇2小时；
2、透明：用二甲苯浸泡2小时，再重复一次；
3、渗蜡：将1/2体积二甲苯加入固定瓶，再加1/2体积熔蜡。在干燥箱中升温至高于石蜡熔点3℃左右，石蜡熔化后取盖，2小时后用熔化的纯蜡渗蜡2小时，重复一次；
4、包埋：将渗蜡过的材料用高于熔点温度3℃左右的纯蜡溶液包埋在叠好的纸盒里；
5、切片：用Leica RM 2015超微切片机（LeicaMikrosysteme, Germany）将样品切成5 μm厚度；
6、展片：把切下的蜡带用毛笔轻轻挑起，放入35℃水浴锅中展片，待完全展开后，用载玻片挑起切片，放入37℃培养箱中干燥；
7、脱蜡：将干燥后的材料依次放入纯二甲苯10分钟（重复一次）、无水乙醇4分钟（重复一次）、95%乙醇4分钟、85%乙醇4分钟、70%乙醇2分钟；
8、甲苯胺蓝染色：使用1%甲苯胺蓝硼酸溶液（W/V）对切片进行染色5分钟，然后95%乙醇2分钟、100%乙醇3分钟（重复一次）、二甲苯10分钟、二甲苯5分钟，中性树胶盖片，放在37℃培养箱中干燥。
用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察甲苯胺蓝染色切片并拍照。用Image-Pro Plus软件测量木质部宽度。
1.9.2 木质素自发荧光观察
未染色的切片用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察，二极管激光器发射405 nm激光，不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。
1.9.3 透射电镜
选取与1.9.1相同的样品，用2.5%戊二醛固定液4℃固定12小时，取材后要迅速投入到新鲜的2.5%戊二醛固定液中；取材应在0-4℃低温下操作，取材的器械和固定液也要预冷；由于固定液的渗透性较差，戊二醛渗透深度为0.5 mm，锇酸的渗透深度为0.25mm，所以样品不宜过大，约为1.5 mm×3 mm，厚度不能超过2 mm；对于漂浮在固定液上面的材料，需要抽气使其完全浸渍于固定液下面，充分固定。用Image-Pro Plus软件测量木质部细胞次生细胞壁的厚度。
1.10 统计分析
SAS软件包对所有数据进行统计分析，使用t测验分析显著性差异，P 0.05 （*），P 0.01 （**）。
3.可行性分析
（1）本研究是为验证PbrNAC1参与梨果实石细胞和木质素合成的功能而提出的，是在指导老师所在课题组研究的基础上形成的。指导老师所在课题组已经对梨果实石细胞形成展开了系统性的研究，初步明确了梨果实石细胞木质素为典型的双子叶植物木质素类型。
（2）试验研究将在南京农业大学梨工程技术研究中心开展，梨工程技术研究中心为我校作物遗传与种质创新国家重点实验室的一部分，具有良好的仪器设备，满足完成本项目的基本实验条件。本研究多数为室内试验，不受季节等因素的影响。
（3）指导老师吴俊教授多年来从事梨的基因组进化、优异资源挖掘与利用、以及分子辅助育种技术等方面的研究，有丰富的经验，可以在试验中指导我，给我一些建议，使得本课题的开展更为顺利。实验室的研究生也将为本课题的开展提供帮助。
（4）本人通过SRT项目阶段的学习和锻炼，了解了相关的实验原理，熟悉了相关的实验流程，实验操作水平有了很大程度地提高。这些均为本项目的顺利完成提供了技术支持和保障。
4. 研究创新点
目前，还没有NAC转录因子被报道能够调控梨果实石细胞木质素的生物合成，研究将有望率先明确PbrNAC1基因对梨果实石细胞及木质素合成的作用，获得的重要功能基因将为梨果实的品质性状遗传改良提供理论依据、技术手段和基因资源。
5. 研究计划与进展
2018.2 种植野生型拟南芥
2018.3～2018.4 用含有pbrnac1过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染拟南芥，成熟后收取种子
2018.5～2018.7潮霉素筛选获得潮霉素抗性的t1代植株，种植，成熟后收取种子
