梨果实苹果酸代谢相关基因的挖掘及分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：

梨起源于中国，且我国作为世界上梨果树种植面积最大、产量最多的国家^[1]，具有丰富的梨品种资源：首先其分布极广：在南、北方均有种植，其次随地域分布种类繁多而有多个系统。在日常生活中，梨果以其口味品质及营养功效深受喜爱，同时在“孔融让梨”等传统文化氛围的熏陶下，梨在我国拥有重要地位。

在大多数梨果实中，苹果酸（malic acid，ma）是最主要的有机酸^[2]，在植物中也充当了基本的碳分子储藏器参与多种代谢过程，是果实生长发育中关键指标性物质。苹果酸还可作为营养物质对人体产生积极影响，经实验得知苹果酸可促进人体对药物的吸收、提高对钙元素的吸收作用^[3]，即有望发展成为优良的保健功能成份。果实中苹果酸的含量是由其合成、降解和区域划分布来共同决定^[4]，受其相关基因表达的调控。因此，挖掘及分析梨果实中苹果酸代谢相关基因以提高果实品质和营养风味就显得十分重要。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

围绕梨中苹果酸代谢相关基因的挖掘和分析这一核心科学问题，本实验采用生物信息学分析的方法，挖掘出梨果中与苹果酸合成、分解与转运相关的基因；进一步通过构建瞬时表达载体，验证关键基因的功能；最后，分析其在不同组织部位及果实发育不同时期基因表达模式。通过本项目的实施将会为改良梨果实苹果酸含量提供基因资源。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

（1）苹果酸代谢相关基因的鉴定

查询拟南芥数据库中苹果酸合成、代谢及转运候选基因，对‘砀山酥梨’基因组数据库进行BLASTP分析。将所有候选基因的氨基酸序列提交至InterProScan、Pfam和SMART数据库，检测其是否存在保守结构域。然后，利用DNAMAN将候选蛋白序列与其他植物中的相关序列进行对比以检验保守模块。接着利用ExPASY中的ProtParam在线分析工具分析苹果酸代谢相关蛋白质的理化性质，同时，使用CELLO v2.5 server预测亚细胞定位和利用SWISS-MODEL server软件预测相关蛋白质的3D结构组成。最后，采用最大似然估计法（ML）和重复1000次的自展分析，通过琼斯泰勒顿（JTT）模型构建系统进化树。

（2）苹果酸代谢相关基因的功能验证

使用高保真KOD-Plus-Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo，Osaka，Japan）扩增PbrcyNAD-MDH和PbrcyNADP-ME基因的全长序列，插入pSAK277载体构建具有CaMV 35S启动子的过表达载体。将过表达载体和空载转入农杆菌株EHA105，28℃恒温培养至OD₆₆₀1.0。利用渗透缓冲液（10 mM MgCl₂、10 mM MES、pH 5.5和150μM乙酰丁香酮）悬浮菌株后，将50 μL溶液缓慢地注入‘砀山酥梨’果实。25°C贮藏5天后进行取样，比较关键基因表达情况。

（3）苹果酸代谢相关基因的表达谱分析

分析‘丰水’梨不同组织部位（叶、花、种子、茎和果皮）及5个生长发育阶段（坐果期、生理落果期、果实快速膨大期、果实膨大期后一个月、商业成熟期）苹果酸代谢相关的关键基因表达量。

技术路线:

实验方案：

（1）候选基因的筛选：

利用拟南芥对砀山酥梨基因组数据库（http://peargenome.njau.edu.cn）进行BLASTP分析。所有候选基因的氨基酸序列提交至InterProScan、Pfam和SMART数据库，检测其是否存在保守结构域。最后，利用DNAMAN将候选蛋白序列与其他植物中的cyNAD-MDH（或NADP-ME）序列进行对比，检验保守模块。

（2）理化性质，亚细胞定位和蛋白质三维结构分析：

采用ProtParam（http://web. expasy.org/protparam/）计算理化参数，利用CELLO v2.5 server（http://cello.life .nctu.edu.tw /）预测亚细胞定位。采用SWISS-MODEL server（https://www.swissmodel.expasy.org/interacti ve/dKBKSG/models/）预测蛋白质3D结构。

（3）系统进化树：

分析采用最大似然估计法（ML）和重复1000次的自展分析，通过琼斯泰勒顿（JTT）模型构建系统进化树。

（4）基因克隆：

使用TRizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取总RNA。利用TransScriptOne-StepgDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix（TRANSGEN，China）试剂盒将约2 μg总RNA合成cDNA第一链。以cDNA作为模板，通过PCR扩增出基因cDNA。将纯化的PCR产物插入pCAMBIA 1302载体中，再转入大肠杆菌DH5α，测序。

（5）实时荧光定量PCR：

使用Primer Premier 6.0设计基因引物。TRizol试剂（Invitrogen，USA）提取总RNA后，利用TransScriptOne-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix（TRANSGEN，China）将约2 μg总RNA合成cDNA。采用LightCycler 480 SYBR GREEN1进行qRT-PCR。以梨Pbrtublin作为内参基因，采用2^-△△Ct法计算相对表达量。

（6）瞬时表达：

使用高保真KOD-Plus-Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo，Osaka，Japan）扩增PbrcyNAD-MDH和PbrcyNADP-ME基因的全长序列，插入pSAK277载体构建具有CaMV 35S启动子的过表达载体。将过表达载体和空载转入农杆菌株EHA105，28 ℃恒温培养至OD660 1.0。利用渗透缓冲液（10 mM MgCl₂、10 mM MES、pH5.5和150μM乙酰丁香酮）悬浮菌株后，将50 μL溶液缓慢地注入果实。25°C贮藏5天后取样。

可行性分析：

（1）理论基础

随着测序技术的快速发展，我们实验室已经完成对梨（Pyrus bretschneideri cv.Dangshansuli）的基因组的测序,有助于全基因组的测定和基因家族成员的分析。

研究表明，果实中苹果酸的含量是由其合成、降解和区域划分布来共同决定。通过已有研究可知，cyNAD-MDH被认为是参与苹果酸合成的最后一步的关键酶，而cyNADP-ME在果实成熟的过程中对苹果酸的降解起重要作用。果树中超过85%的苹果酸都位于液泡中。液泡中的H -ATPase(V-ATPase) 和无机焦磷酸（vVPp）这两个主要的质子泵被提出参与苹果酸在液泡膜

中的运输。包括vVAtps（ncbi登记号ab189963.1和ab189964.1）和vVPp（ncbi登记号ab097115.1）在内的一些基因参与了这一过程并已从梨中克隆出来。

（2）实验材料

本研究采用的试验材料为生长于南京的本课题组位实验果园的果树，树体生长状况良好，结果性状稳定，为本研究的顺利开展提供了优质实验试材的保障。

（3）实验方法与技术路线

通过查阅文献及师兄师姐指导，能够基本确定实验技术路线。并且通过SRT项目对实验环境及基础操作有一定的了解，为今后的实验打下了基础。

（4）项目团队

本课题由两名本科生在一名研究生及一名老师协作下共同完成。团队协作能力强，老师科研能力较高。

（5）实验研究条件

本课题依托于南京农业大学梨中心的相关实验室进行，实验设备较为齐全，条件良好，且实验室内的老师和研究生师兄师姐具有较强的科研能力，为本项目的实施提供了强大的支持。

因此，本项目具有较强的可行性，可期望达到预定目标。

4. 研究创新点

特色或创新之处：

（1）选题来自产业发展需求:苹果酸有望发展成为21世纪一种优良的保健功能成份，它可以有效促进人体对药物的吸收、提高对钙元素的吸收作用。本实验为提高梨果实中苹果酸含量提供理论基础，有利于提高梨果实的品质，为新型功能型保健水果上市做铺垫。

5. 研究计划与进展

研究计划与预期进展：