菊花木质素相关基因CmMYB14的克隆与功能鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 选题的背景及意义

1. 研究背景

   菊花（chrysanthemum morifolium），作为我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有很高的观赏和经济价值。蚜虫是主要的农业害虫之一，通过吸取植物韧皮部汁液，消耗植物养分而直接对植物造成损害，也是病毒传播的媒介之一。菊花易受菊姬长管蚜的影响，蚜虫的侵染不仅阻碍菊花的营养生长，而且影响菊花的品质和产量。

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   2. 研究的基本内容和问题

   1. 研究目标、研究内容及拟解决问题

      2.1研究目标

      （1）克隆菊花cmmyb14基因并明确其表达特性；

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      3. 研究的方法与方案

      1. 技术路线及其可行性分析

         3.1技术路线

      2. 3.2.1研究材料

         南京农业大学菊花种质资源中心保存的切花菊品种‘神马’。

         3.2.2研究手段

         高保真PCR克隆CmMYB14全长；qRT_PCR技术分析表达特性；重组法构建植物表达载体；利用农杆菌侵染法转化‘神马’并进行转基因鉴定，分析转基因株系木质素含量及相关特征。

         3.3具体方法

         3.3.1高保真PCR

         ①根据转录组拼接结果设计CmMYB14全长引物，以cDNA为模板，进行高保真PCR扩增。高保真酶反应体系与程序如下：

         1）反应体系50 μl ：

         5×Phusion HF	10 μl
         dNTPs Mixture (10 mM)	1.0 μl
         上游引物 下游引物	1.0 μl 1.0 μl
         DMSO	1.5 l
         cDNA	1.0 μl
         Phusion DNA Polymerase	0.5 μl
         ddH2O	34 l
         Total	50 μl

         2）反应程序：98℃ 30 sec；98℃ 10 sec，55℃ 30 sec，72℃ 30 sec/kb, 30 个循环；72℃ 7min；4℃保温；

         ②电泳

         将高保真PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取特异性条带进行切胶、纯化；

         ③将上述步骤②中的纯化片段进行加A尾，体系如下：

         10×PCR Buffer	2.5 μl
         Mg2 (25mM)	1.5 μl
         dNTPs Mixture (2.5mM)	2.0 μl
         切胶、纯化片段	18 μl
         rTaq (5U/μl)	1.0 μl
         Total	25 μl

         混匀，离心，72℃保温30 min；

         ④加A尾产物再进行纯化，所使用的纯化试剂盒是：TaKaRaDNA Fragment Purification kit Ver.4.0。

         ⑤上述步骤④中的纯化产物进行连接、转化、测序。

         3.3.2荧光定量（qRT-PCR）

         每20 μl qPCR反应液中包含10 μl SYBRGreen PCR master mix，上、下游引物各0.5 μM以及10 ng cDNA。加样体系如下：

         SYBR Premix Ex TaqTM II	10.0 μl
         Forward primer （10 M）	1.0 μl
         Reverse primer （10 M）	1.0 μl
         cDNAtemplate	5.0l
         RNaseFree dH2O	3.0 μl
         Total	20.0 μl

         把荧光定量板置于Mastercycler ep realplex2 S（Eppendorf，德国）定量PCR仪中，设定荧光采集通道以及读取荧光步骤，PCR反应按照以下反应程序进行：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55~60℃ 15 s，72℃ 20 s，40个循环；最后加入溶解曲线。每个样品进行重复试验3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，假定扩增效率为100%，并假定标准曲线及每次扩增之间的效率保持一致，选取CmEF11α，作为内参基因，采用2^-Ct法进行相对定量。

         3.3.3载体构建

         得到目的基因全长序列后，对ORF框序列进行酶切位点分析。以含有CmMYB14基因的pMD19-T质粒为模板，高保真PCR扩增包含载体酶切位点的目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收。将纯化产物和入门载体pENTR1A质粒同时进行双酶切，纯化的CmMYB14与pENTR1A载体酶切产物进行16℃连接，转化大肠杆菌感受态，获得含有目的基因的入门载体，再通过同源重组构建至相应表达载体上。

         3.3.4亚细胞定位

         通过烟草注射法，将包含目的基因的农杆菌注入烟草表皮细胞，暗培养2~3天后在激光共聚焦下观察荧光发生部位，从而确定CmMYB14基因表达部位。

         3.3.5转录激活活性分析

         制备感受态酵母细胞后，将热激转化后的酵母分别涂抹于不同的缺陷培养基上。pGBKT7载体作为阴性对照，而pCL1作为阳性对照。pGBKT7-CmMYB14和pGBKT7空载体涂抹在SD/-Trp培养基上，而阳性对照涂抹于SD/-Leu培养基上，30℃，倒扣培养2-4 d。然后把长出的酵母菌落转到SD/-His-Ade上进行筛选。30℃培养2 d，检查生长情况。而后，根据结构域将CmMYB14全长分段构建到pGBKT7载体中然后转化到酵母菌株中，在缺His和Ade的培养基上确认各部分的转录激活活性。

         3.3.6蚜虫接种鉴定

         采用农杆菌介导法获得超表达转基因植株，选取长势一致的6-8叶龄的转基因菊花和野生型对照扦插苗，以饥饿处理4 h后的菊姬长管蚜作为接种虫源。每株接种5头，每处理20株，实验重复3次。统计21天后的虫口数目，分析转基因植株抗蚜性。

         3.4可行性分析

         （1）实验室具备完善的载体构建方法及成熟的菊花转基因技术体系；

         （2）所在的菊花课题组具有良好的研究基础，指导教师长期从事菊花优异基因挖掘与功能鉴定研究；

         （3）项目所需仪器设备皆已具备。

      4. 研究创新点

      四、项目特色

      实验室已克隆出多个MYB基因并初步鉴定了其表达特性及调控机制。然而菊花CmMYB14的克隆和功能鉴定尚未见报道。本研究在前期发现CmMYB14具有蚜虫取食差异表达的基础上，开展菊花中CmMYB14全长的克隆，并分析其表达特性，进行遗传转化菊花，观察其对蚜虫取食的影响，探讨其调控菊花木质素合成的功能。为菊花抗蚜性分子改良提供基因储备与理论依据，具有重要科学意义和应用价值。

      5. 研究计划与进展

      1. 研究计划

         2019.5-2019.8 cmmyb14基因全长序列克隆分析及载体构建

         2019.9-2020.1 cmmyb14基础特性分析及转基因工作

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