一、研究背景
肝脏是人体中最重要的器官之一，在人体内承担着储存肝糖、去氧化、合成多种分泌蛋白等诸多功能。随着人们生活方式和生活环境等因素的改变，肝脏相关疾病的发病率逐年上升，未能得到及时有效治疗的患者的病情可能进一步发展成肝硬化甚至肝癌。胆汁淤积是由于胆汁的形成或分泌受阻而引起的胆汁酸中毒潴留的临床综合征，也是肝损伤的重要临床表现之一，多种肝脏疾病都是由胆汁淤积引起的，包括胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎和原发性胆汁性肝硬化等[1]。相关疾病的治疗药物极少，目前针对胆汁淤积的治疗策略主要是提高过量有毒胆汁酸的排泄，熊去氧胆酸是目前为数不多的用于治疗胆汁淤积症的主流药物之一，但其疗效仅限于原发性胆汁性肝硬化的早期阶段。因此，肝损伤及相关疾病的防治方法及相关药物的研究仍是目前形势严峻的研究领域，研发安全有效的治疗肝损伤的药物有着重要的意义。
鞘脂包括鞘磷脂和鞘糖脂，是哺乳动物细胞膜上的重要脂质组成部分。鞘磷脂可以通过调节多种信号通路促进细胞增殖、迁移、侵袭和转移，可以在多种生物酶的催化下依次生成神经酰胺（Ceramide，Cer）、鞘氨醇（Sphingosine，Sph）和鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-2-phosphate，S1P）[2]。其中Cer和Sph被认为是细胞增殖的负调控因子，介导细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。而S1P位于细胞外间隙时，可以作为第二信使结合并激活细胞表面的特异性S1P受体（S1P Receptors，S1PRs），起到促进细胞生长、转移、侵袭和细胞存活的作用[3]。S1P有两种命运：被S1P裂解酶不可逆地降解或去磷酸化变回鞘氨醇。磷酸鞘氨醇信号通路主要包括S1P及其五种高亲和力G蛋白偶联受体（S1PR1-5），多种酶参与了该代谢途径的调控，正常情况下三者在鞘氨醇激酶（Sphingosine Kinase，SphK）的作用下处于平衡状态，因此SphK被认为是一种重要的限速酶，能够催化Cer和Sph向S1P的转化[4]。
SphK是一种高度保守的脂质激酶，在不同类型的细胞和组织中活性不同，体内多种生长因子均可激活SphK，如神经生长因子、血管内皮生长因子等，目前已经在哺乳动物中发现了SphK1和SphK2两种异构体，它们在体内分布以及生物学功能方面均存在差异[4]。研究表明，高表达的SphK不仅可以刺激细胞生长，还可以导致正常细胞的恶性转化[5]。
肝脏对损伤产生反应所释放的S1P会促进多种免疫细胞的招募，从而导致肝脏炎症。例如被称为库普弗细胞（Kupffer Cell）的驻肝巨噬细胞等。在病毒诱导的兔急性肝损伤模型中，SphK1、S1P水平和S1PR1在肝脏中的表达均增加，并与TNF-alpha;和IL-6水平以及疾病严重程度正相关[6]。进一步研究表明，使用S1PR1的功能性拮抗剂FTY720或KRP203在刀豆素A介导的T细胞依赖性肝损伤模型中具有保护作用[7]。同样，在脂多糖(LPS)诱导的肝功能衰竭模型中，可发现S1P在肝脏中积聚，且S1PR1表达上调[8]。可见，S1P信号参与诱导炎症介导的肝损伤。
SphK-S1P信号通路在脂肪肝等代谢疾病中也有着重要作用。S1P促进脂肪细胞分化和肝脏中脂质的积累，从而诱导产生非酒精性脂肪肝。临床研究显示非酒精性脂肪性肝炎患者的肝脏中SphK1水平升高，在高果糖饮食诱导的脂肪性肝炎大鼠模型中，也观察到肝脏SphK1和S1PR的升高[9]在非酒精性脂肪肝小鼠模型中，使用S1PR1的功能性拮抗剂FTY720可降低小鼠的肝脏/体重比，同时减轻了小鼠的肝脏炎症、纤维化和肝细胞气球样变[10]。
研究表明，S1P可以通过激活S1PR促进骨髓间充质干细胞（BMSC）的募集。在肝脏中，这些细胞分化为肝星状细胞，当静止的星状细胞因肝损伤而被激活时，它们会再次分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞表达alpha;-平滑肌肌动蛋白并分泌I型胶原，以S1P依赖的方式形成纤维化的细胞外基质，从而导致肝纤维化[11]。
SphK-S1P信号通路在肝癌细胞系和患者样本中过表达，S1P表达量在患者血清和肝癌肿瘤中大幅升高，表明该信号通路在肝癌的发生发展中可能起到促进作用[12]。因此，抑制SphK-S1PR信号通路被认为是治疗肝癌等肝脏疾病的有效途径。临床前研究表明，降低肝癌肿瘤细胞生长的药物，如褪黑激素或天然的戊烯基黄酮类淫羊藿苷可能是由于SphK1的抑制和S1PR的激活减少所致[13]。SphK1/2双抑制剂SKI-II有减少肝癌细胞存活和迁移，减轻肝损伤的作用，目前该药物被发现可与5-氟尿嘧啶或MEK1/2抑制剂联合使用产生协同作用[14]。
有相关研究表明，胆汁酸通过啮齿动物肝细胞和体内的S1PR2激活下游信号通路，从而引起肝脏及胆道相关疾病[17]，因此，可以通过抑制SphK-S1P信号通路产生治疗胆汁淤积等肝脏疾病的作用。虽然目前对SphK-S1P信号通路的抑制剂有较多的研究，但仅有少数相关抑制剂用于临床，该领域的相关药物急需进一步的研究。
石胆酸（LCA）是一种有毒的、疏水的次级胆汁酸，主要由鹅去氧胆酸的7alpha;-去羟基化在肠道中形成[15]。在胆汁淤积患者中可以发现LCA水平升高的现象，且给予LCA的啮齿类动物会产生胆汁淤积的症状[16]。因此，本课题拟采用石胆酸诱导建立小鼠胆汁淤积模型，并通过测定小鼠血清总胆汁酸含量、谷丙转氨酶含量等生化指标评价LZY的肝脏保护作用，测定SphK、S1PR表达的变化，探究化合物LZY是否通过SphK-S1PR信号通路发挥保肝作用。
