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1.恶性肿瘤及治疗药物 恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病,其特点是细胞或变异细胞异常增殖.目前人类因恶性肿瘤引起的死亡占所有疾病死亡率的第二位,仅次于心脑血管疾病。由于现有抗肿瘤药物存在毒性大、易产生耐药性等缺点,所以研制靶向性抗肿瘤药物一直是全球药业公司和各国政府重点关注和发展的领域。 人类基因组测序工作的完成以及分子生物学对疾病机理的不断了解和阐述,使得药物发现从传统的动物模型筛选发展到针对致病机理中关键酶或受体来精确设计靶向性药物,通过小分子抑制剂特异性结合到靶蛋白上,选择性地阻断肿瘤细胞的过度增生,从而有效控制和治疗疾病。在分子靶向药物中,蛋白酪氨酸激酶抑制剂的开发尤为引人注目,其成功范例如格列卫(Gleevec)、易瑞莎(Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib)先后被美国食品药品管理局(FDA)批准上市,充分证明了蛋白酪氨酸激酶是一个非常富有前景的抗肿瘤药物靶标。 |
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2．蛋白酪氨酸激酶的结构和功能 蛋白酪氨酸激酶(PTK)是信号传递过程中的重要因子,参与一系列细胞功能, 与细胞生长、分化、增殖密切相关[1～3],它催化ATP的gamma;磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上,使酚羟基磷酸化,从而传递信号。 酪氨酸激酶属于蛋白激酶家族,按其结构可以分为两大类:受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor PTKs)和非受体酪氨酸蛋白激酶(Non-receptor PTKs),这两类酪氨酸蛋白激酶按结构同源性可进一步分为多个酶属。人类基因组数据的分析表明,人体共有518 种激酶基因[4],其中90种PTKs已被发现,包括受体型的酪氨酸激酶58种和非受体型的酪氨酸激酶32种[5]。受体型的酪氨酸激酶包括血小板生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)等成员,它们通常具有一个细胞外结构域、一个跨膜区以及一个细胞内激酶域。癌症临床研究表明,这些受体及其配体与很多肿瘤都有重要联系, 很多癌症出现了相关生长因子的过量表达,导致过量的酪氨酸磷酸化信号传入细胞。 非受体型的酪氨酸激酶(nrPTKs)一般没有细胞外结构,它们通常与细胞膜耦联或存在于胞质中,包括Abl激酶、Src激酶、C-端Src激酶等成员。在肿瘤组织中nrPTKs常被激活,再激活下游的信号传导途径,促进细胞增殖、抵抗细胞凋亡,促使肿瘤发生和发展[6～8]。 3.不可逆酪氨酸激酶抑制剂 正因为酪氨酸激酶在细胞的恶性生长和增殖中起着非常重要的作用,所以酪氨酸激酶抑制剂对恶性肿瘤有预防和治疗作用。十几年来，先后有数十种酪氨酸激酶抑制剂上市，然而随着药物使用范围扩大，近年来出现了越来越多的耐药病例，开发效果更优的新型抑制剂迫在眉睫。 以前由于不可逆抑制剂是共价结合，其作用是不可控制的，药物研发往往回避含亲电基团的化合物。近年来对共价结合原则理解的深入以及数个有效并安全的共价结合药物上市，人们对共价结合的药物研发重新燃起了兴趣[9]。目前越来越多的不可逆酪氨酸激酶抑制剂已经进入了临床并显示出优秀的活性和安全性。 相比传统药物，不可逆抑制剂能最大程度占据激酶，即使游离药物被清除后，化合物依然存在于靶蛋白上，延长了作用时间，同时由于共价结合的药物，配体效率往往高于非共价结合，有利于提高抑制活性，降低给药剂量。对于耐药突变株，有良好的治疗前景。 如辉瑞公司研发的Dacomitinib：
Dacomitinib（PF-00299804） (2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-甲氧基-6-喹唑啉基]-4-(1-哌啶基)-2-丁烯酰胺 目前正进行III期临床研究。是一种喹唑啉类可口服，高选择性，靶向HER1、2、3的多激酶抑制剂，能够不可逆地与HER受体中催化域的半胱氨酸残基结合。在体外实验中，与厄洛替尼相比，对EGFR的IC50分别为 6.0nmol/L和 0.56， 对HER2分别为45.7和512 nmol/L，对HER4分别为73.7和790nmol/L。在细胞试验中，对EGFR的IC50为5.8 nmol/L而厄洛替尼为19.3；对HER2活性为41 nmol/L而厄洛替尼则为299。对于有L858R/T790M突变的NSCLC细胞株H3255 GR和H1975的IC50分别为 119和440 nmol/L。在延长晚期非小细胞肺癌无进展生存期上疗效超过厄洛替尼（中位数分别为2.8个月和1.9个月）。不仅适用于初始治疗，更可用于第一代TKI治疗失败的患者。 Dacomitinib跟ATP竞争与EGFR的结合。与可逆TKI不同的是，Dacomitinib通过麦克尔受体共价结合Cys773，不可逆地阻断了ATP与酶的结合，致使酶活性丧失。细胞实验表明Dacomitinib较可逆EGFR抑制剂有更大的潜力。由于其不可逆的特点，表现出很低的解离率，药效学实验揭示，其对酶的抑制，只能通过合成新的蛋白质来解除。对突变株的抑制能力超越了一线药物。尤其是对于一线药物无效的EGFR T790M突变。这一特点将改变对于EGFR突变的NSCLC治疗定势。 在安全性上，Dacomitinib在毒副作用上与第一代TKI类似。 I期临床实验证明了它的安全性，并有良好的耐受性，最大耐受剂量为每日45mg。Dacomitinib是一个独特的的泛HER抑制剂，对整个HER家族有很强的阻断作用，不可逆的特性对激活通路也有长时间抑制。而其最大的优势，在于对T790M突变的治疗活性远胜于厄洛替尼和吉非替尼，使其成为一个重要的候选药物。 4.阳性药的合成 选择Dacomitinib为阳性药，对其进行合成，路线如下： 得到阳性药以后，对其进行结构改造与修饰，以期提高选择性，降低毒副作用。 对4位基团，使用一个杂环氨基替换。1位氮杂原子需保留，而3位氮可以替换为碳原子，并且使用CN取代，构效关系表明CN可以缩短与甲硫氨酸769的距离。6位在维持丁烯酰胺结构的基础上，哌啶可换为二甲胺基取代。7位对体积要求不高，推测这些基团不与受体表面结合，但可增加分子水溶性，用于优化化合物理化性质。 5.生物活性测试 a.体外活性测试 测定化合物在体外对小鼠黑色素瘤B16；人胃癌SGC-7901；人卵巢癌A0；人红白血病K526；人白血病HL-60；白血病K562细胞；人宫颈癌HeLa；人肺癌细胞A549；人肝癌细胞SMMC-7721；结肠癌HCT8 细胞；人脑瘤细胞SF-763；小鼠腹水瘤S180等恶性肿瘤细胞的抑制活性。 （1）四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验：在96孔细胞培养板中加入浓度依次为10、20、40、80、160mg·L-1 的化合物样品,培养3d,每孔加入5g·L-1MTT20mu;l 继续培养4 h，轻轻吸去上清液,加入1mmol·L-1 盐酸-异丙醇。每孔的沉淀物用吸管用力吹打均匀,用核酸蛋白检测仪进行检测,计算细胞生长抑制率:生长抑制率=（1-实验孔OD 值/对照孔OD 值）times;100%。 （2）电镜观察：接种一定浓度的细胞，培养24h后加入30mg·L-1的受试物继续培养24h。收集细胞，常规固定，包埋后切片，电镜观测并摄像记录。 （3）流式细胞术分析细胞周期分布：药物处理细胞24h后，收集对照组(给等量无药培养液)及给药组细胞，用PBS 洗涤2 次，1000r·min-1 离心15min，加1% Triton X 100，37℃孵育，离心，加0.005%PI染色，用300目尼龙网过滤，15min 后用流式细胞仪检测。
（1）荷瘤小鼠的抑瘤实验：取小鼠B16细胞系对数生长期细胞，用生理盐水配成一定浓度接种于BALB/C小鼠的脚掌(2.4times;106/只)。共分5组，对照组(不给药)，100mg/kg，300mg/kg，600mg/kg，前四组在接种B16 黑色素瘤细胞后的第二天就连续15 天给小鼠灌胃。最后一组在前四组已灌胃10 天，这组小鼠肿瘤平均体积已长至11.38 mm3，再开始给药，同样连续灌胃15 天停药，以后每3 天用游标卡尺测一次肿瘤体积，公式:atimes;b2 （a 为长径，b 为短径）。 （2）肿瘤组织的电镜观察：小鼠实验结束时,取100mu;ｇ/ml，300mu;ｇ/ml，对照组小鼠的肿瘤组织块进行常规的戊二醛固定、包埋后,切片测定并进行拍照记录。 （3）细胞周期及DNA碎片的分析：小鼠实验结束时,取300mg/kg，600mg/kg（形成肿瘤后再治疗的小鼠）,对照组的肿瘤组织块，用剪刀剪碎、匀浆、尼龙网过滤，用PBS 洗涤3 次，1000转/分离心，加1% Triton Ｘ 100，33℃孵育，离心，加0.01% KNA 酶消化，离心，加0.005% PI染色，用300 目尼龙网过滤，15 分钟后上机检测。 参考文献 1) Pawson, T. Eur. J. Cancer 2002, 38, S3. 2) Suhardja, A.; Hoffman, H. Microsc. Res. Tech. 2003, 60, 70. 3) Bikfalvi, A.; Bicknell, R. Trends Pharmacol. Sci. 2002, 23, 576. 4) Manning, G.; Plowman, G. D.; Hunter, T.; Sudarsanam, S. Trends Biochem. Sci. 2002, 27, 514. 5) Dan, R. R.; Yi, M. W.; Su, F. L. Oncogene 2000, 19, 5548. 6) Summy, J. M.; Gallick, G. E. Clin. Cancer Rev. 2006, 12, 1398. 7) Schenone, S.; Manetti, F.; Botta, M. Curr. Pharm. Des. 2007, 13, 2118. 8) Weisberg, E.; Manley, P. W.; Cowan-Jacob, S. W. Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 345. 9) Singh J, Petter RC, Baillie TA, et al. The resurgence of covalent drugs[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2011, 10(4): 307-317. |
资料编号：[391195]
