慢病毒介导的VEGF基因表达载体的构建文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、拟研究的问题

如今糖尿病仍然是人类所面临的一个重大疾病问题，既往的研究多集中于alpha;，beta;等胰岛内分泌细胞，但最新的研究表明，在糖尿病小鼠模型中，胰岛微血管也有不同程度的损伤。胰岛是高度血管化的器官，胰岛微血管与beta;细胞紧密相连，具有独特的窗孔结构，在保证胰岛细胞供血的同时，有利于各种营养物质及生长因子的供给，并能促使beta;细胞对血糖变化做出快速、准确的反应。作为胰岛微血管的重要组成部分，胰岛微血管内皮细胞（islet microvascular endothelial cells, IMECs）与胰岛beta;细胞密切相关。beta;细胞能分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A），后者通过与胰岛微血管内皮细胞上的特异性受体结合，调控血管通透性，促进新生血管形成，缓解微血管损伤。本实验旨在以pLVTH慢病毒载体构建VEGF-A重组慢病毒颗粒并使其在小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）内过表达，建立一种新的真核细胞表达系统，为后续的VEGF-A治疗糖尿病的相关研究提供现实基础。

二、研究目标、采用的手段

• 研究目标：

本研究最终目标是探究VEGF-A与糖尿病治疗的相关性，在此背景下，需要构建VEGF-A的真核表达系统，通过将其包装成慢病毒颗粒并转染至MSC细胞中，为后续VEGF-A过表达对糖尿病的研究打下基础。

• 研究手段：

1. VEGF-A重组质粒的制备和扩增

确定小鼠VEGF-A蛋白质编码区序列，由公司合成以pLVTH为载体的带C端HA标签的重组VEGF-A质粒。将重组质粒转染入DH5alpha;感受态细胞，用抗性平板筛选阳性菌株，扩增阳性菌株，提取质粒并保存。

1. 慢病毒包装与滴度检测

将重组质粒与包膜质粒、包装质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染入293T细胞，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度，收集病毒滴度合适范围内的慢病毒颗粒。

3、MSC感染及鉴定

将慢病毒颗粒转染至小鼠骨髓MSC细胞中，HA抗体Western blot鉴定MSC-VEGF-A细胞株中VEGF-A的表达。

三、文献综述