基于HPLC/Q-TOF技术对NTS在大鼠体内代谢产物的分析与鉴定文献综述

 2022-12-06 05:12

开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)

(一)拟研究问题:

该课题以新对叶百部碱(NTS)为研究对象,经大鼠灌胃给药后,收集所代谢的生物样品(血液、胆汁、尿液、粪便)。对生物样品的代谢产物进行分析与鉴定。研究新对叶百部碱(NTS)在大鼠体内的代谢产物结构,推测出NTS代谢途径。

  1. 研究手段:
  2. 利用高分辨液质联用技术(HPLC/Q-TOF),检测NTS在大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便的代谢产物;
  3. 以NTS为结构母核,采用MDF(质量亏损)数据处理技术优化图谱,寻找大鼠体内代谢产物;
  4. 应用常见生物转化规律知识及质谱二级碎片离子解析代谢产物,推测代谢产物的结构及其代谢途径。
  5. 实验内容:

该实验基于HPLC/Q-TOF技术对NTS在大鼠体内代谢产物的分析与鉴定。首先大鼠给药后,按照预先设计的时间点,采取眼眶取血方法收集血液、胆管插管方法收集胆汁,代谢笼收集尿液和粪便。先将生物样品置于-20℃冰箱,然后转于-80℃环境下保存。下一步对生物样品进行预处理,制备分析样品。利用高分辨液质联用技术,检测生物样品中的代谢产物。采用质量亏损数据处理技术优化图谱,应用生物转化规律知识及质谱信息解析代谢产物,推测代谢产物的结构及代谢途径。

  1. 预期结果:
  2. 鉴定出新对叶百部碱在大鼠体内代谢产物的结构;
  3. 确定新对叶百部碱在大鼠体内的主要生物转化类型;
  4. 推测出新对叶百部碱在大鼠体内的代谢途径情况。
  5. 文献综述:

百部始记于《名医别录》,在后世《本草纲目》、《本草拾遗》、《药性论》等医书均有记载,是我国常用中药。2015年版《中国药典》收录的百部为百部科植物直立百部Stemona sessilifolia ( Miq.) Miq.、蔓生百部Stemona japonica ( Bl.) Miq.或对叶百部Stemona tuberosa Lour.的干燥块根。味甘、苦,性微温。功能与主治为润肺下气止咳,杀虫灭虱。用于新久咳嗽,肺痨咳嗽,顿咳;外用于头虱,体虱,螭虫病,阴痒。蜜百部润肺止咳。用于阴虛劳嗽[1]。现代研究表明百部属植物主要活性成分为生物碱,除此之外还有1,2–二苯乙烯类衍生物等成分,这些化合物具有杀虫、抗菌、镇咳祛痰等方面的生物活性[2]。对叶百部在我国分布最广,为临床最常用品种。对叶百部中百部生物碱主要以百部碱、对叶百部碱、新对叶百部碱、斯替宁碱、氧化对叶百部碱、原百部碱等为主[3,4]。其中新对叶百部碱(neotuberostemonine, NTS)为stenine型生物碱,结构中含有两个alpha;-甲基-gamma;-丁内酯环[5]。药理研究表明新对叶百部碱对柠檬酸诱发的豚鼠咳嗽具有明显的抑制作用[6,7]

药物体内过程主要包括吸收、分布、代谢、消除、效应、毒性,简称ADMEAT[8]

其中药物代谢转化贯穿整个体内过程,是研究药物和机体相互作用的重点,是药物进入机体后对药物进行处置的一个不可缺少的重要环节。药物代谢是指药物吸收分布之后再血液或组织中的生物转化过程。生物转化是指药物在生物体内的化学反应。生物转化的产物称为代谢产物。 通过药物代谢的研究,确定药物体内生物转化产物的结构,阐明药物代谢的机理与代谢相互作用,可以揭示药物发挥药效及产生毒副作用的机制、可以知道临床药物应用及治疗和毒副作用的监测;可以评价新药的药代特征,更快地寻找到具有临床疗效的候选药物[9,10,11]

在药物代谢研究实验中,鉴定生物样品中的微量代谢产物的工作是非常重要的。尤其是在研究体内生成的不稳定的代谢物中间体,揭示药物代谢途径及作用机制时,分析鉴定工作就显得极其重要了。

总的来说,代谢产物在生物样品中的浓度很低,加上内源性物质(蛋白质、脂肪酸、糖类等低分子量物质)的干扰,对代谢产物的检测尤为困难。因此,代谢学研究实验的分析方法要求具有高灵敏度、高特异性、高通量和无偏向性的特点[12]。近几年,快速发展起来的各种色谱波谱技术大大加快了代谢物的分析过程,提高了检测准确度。下面介绍几种常用于代谢学研究的分析鉴定方法:

  1. 核磁共振(NMR)技术:利用核磁共振技术和模式识别方法对生物样品进行系统测和分析,整个实验中对实验动物随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量。进而确定相关的代谢信息。该方法主要优点在于具有无损伤性,不会破坏样品的结构和性质;可在一定的实验范围内选择实验条件,没有偏向性,对所有的化合物而言,灵敏度都一样;分析周期短,可以满足代谢学研究分析需要的高通量要求。虽然NMR可对复杂的生物样品进行非破坏性分析,但由于该技术对每一个分子的化学及物理环境敏感,也存在其所不足之处。主要有分辨率不高、检测动态范围有限,难以同时检测生物样品体系中共存的浓度相差较大的代谢产物,所需的硬件的费用投入也较大。
  2. 质谱(MS)技术:利用离子化技术,把物质粒子(原子或分子)转化为气态离子,并将气态离子通过电磁场按空间位置、时间先后或轨道的稳定与否等实现不同质荷比大小的分离和检测。质谱仪按质量分析器分类有四级杆质谱、离子讲质谱、飞行时间质谱以及复合式串联质谱。质谱具有自动化、灵敏度高、选择性好、经济实用、功能强大等优点,但也存在离子化程度和基质干扰等问题[13]
  3. 色谱技术:利用各物质在两相中具有不同的分配系数达到分离鉴定目的,常用的色谱技术有气相色谱(GC)、液相(LC)、超临界流体色谱。色谱技术具有强大的分离能力和高灵敏度等特点。不足之处在于用于高通量的样品轮廓谱分析时,分析时间长、样品预处理复杂、系统稳定性和重现性差。
  4. 基于核磁共振、质谱和色谱的联用技术:日趋发展成熟的色谱波谱联用技术将色谱分离和波谱鉴定结合起来,具有其它代谢物分析方法所无法比拟的优点。这些技术主要有:GC/MS(气质联用的技术)、LC/PDA(高效液相色谱结合二极管阵列检测法)、LC/MS(液质联用技术)、LC/NMR(高效液相色谱结合质谱联用技术)、LC/NMR/MS等[14,15,16,17]

除了以上分析鉴定技术外,研究药物体内代谢的分析方法还有毛细管电泳法、同位素示踪等方法。前者具有高速高效的特点,结合手性试剂能够有效的分离手性异构体,也可与质谱联用,有望成为研究手性药物代谢的立体选择性和药代动力学的有效工具。同位素示踪法以其高灵敏度和直观性如自显影技术,而在药物代谢研究中被广泛应用。放射免疫分析技术将免疫学和放射化学结合起来,兼有高度的特异性和灵敏度。还有刚发展起来的竞争蛋白结构分析、受体分析、以及酶、荧光素、化学发光和生物发光等为标记的非同位素标记免疫分析等[18]

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