海胆黄多糖的分离纯化研究文献综述

研究背景：

海胆是一种低等的海洋无脊椎动物，属于棘皮动物门海胆纲。海胆黄为名贵的海产珍品，具有极高的营养价值和药用价值。我国是海胆资源比较丰富的国家，约有100多种，包括8目，27科，69属。本研究所选用的光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus ）是我国主要经济海胆之一，在我国分布较广。雌海胆的生殖腺即海胆黄为名贵的海产珍品，被称为“云丹”，含有丰富的蛋白质、多糖、脂肪酸、维生素及各种微量元素等对人体十分有益的营养成分^[1]因而海胆不但具有较高的食用价值，同时还有极好的药用价值，尤其对增强人体免疫力、防治心血管疾病有较好的效果。

海胆黄多糖（Polysaccharide from the eggs of Strongylocentrotus nudus,SEP）是从光棘球海胆的海胆黄中分离纯化得到的均一多糖组分，纯度达99.4%，相对分子质量^[2]1950k左右，研究发现^{[3, 4]}：SEP在体内刺激淋巴细胞增殖，促进细胞因子分泌，抑制S180实体瘤和肝癌H22细胞的体内生长的作用，抑瘤率达60.1%。实验室海胆黄经丙酮脱脂、热水浸提、去蛋白和乙醇沉淀得到粗多糖的提取纯化的技术成熟，但实验室提取规模远远不能满足临床前研究的需求，因而迫切需要进行大规模生产海胆黄多糖的工艺建立与优化。在企业进行了小试和规模化提取工艺探索，公斤级投料、吨级水提取、搪瓷釜萃取分层除蛋白、冷乙醇沉淀提取海胆黄粗多糖的技术^[5]，及放大柱直径离子交换层析DEAE-52和Sephacryl S-400柱层析纯化规模，以满足临床研究需求。

海胆黄进行预处理、提取及浓缩，酶解-Sevag^[6]法联用除蛋白，乙醇沉淀，洗涤干燥便可得到海胆黄粗多糖。这些过程下来除掉了大部分的蛋白和色素类等杂质。获得高纯度的精品多糖还需要进一步纯化，一般包括大孔吸附树脂除色素、弱阴离子交换层析法除蛋白等带少量负电荷的物质，凝胶层析法分离不同分子量的多糖^[7]体积大的酸性、中性及黏多糖可首先用阴离子交换柱层析初步纯化。多糖在不同洗脱剂作用下通过吸附与解吸附作用得以分离，控制洗脱剂pH值使多糖溶液中部分蛋白质和色素得到吸附而使多糖得到初步纯化。

在以往的实验过程中，分离多糖时，常先将得到的粗多糖通过溶解、离心、上清液用切向流超滤浓缩装置浓缩、浓缩液上离子交换柱DEAE-Fast Flow（柱直径10 cm，高度为20 cm，填料体积1 L），超纯水洗脱后，再上Sephacryl S-400 凝胶层析柱，超纯水洗脱，收集的洗脱液透析后真空冷冻干燥。但凝胶层析需要分次上样，海胆黄精多糖SEP的产量还远远不能满足临床前研究及企业规模化生产的要求，规模化时只能通过放大直径及柱高，但增加柱高需要考虑填料及柱子的承压能力；超滤可以除掉小分子物质又能够起到浓缩作用，可考虑超滤方法分段截留目标多糖代替凝胶层析纯化方法。李琳等^[8]用自行研制的全自动超滤浓缩中试系统对南瓜多糖溶液进行超滤浓缩，考察南瓜粗多糖对全自动超滤浓缩分离中试系统运行时膜分离性能的影响，为南瓜多糖的产业化生产以及全自动超滤分离系统的推广应用提供理论基础。

本实验拟研究海胆黄粗多糖中试超滤纯化工艺和DEAE-52离子交换层析法纯化SEP的工艺放大。先是将粗多糖溶解，放入高速冷冻离心机中离心，然后将离心后的多糖溶液通过0.45mu;m的滤膜过滤，反复超滤三次，得到浓缩液。浓缩液上离子交换柱DEAE-52，超纯水洗脱，将洗脱液合并后，使用转转蒸发仪旋蒸，然后将浓缩液铺至平皿中，冻干机进行冻干。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量^[9]，采用Folin-酚法测定蛋白质含量^[10]。通过JSCO高效液相色谱系统^[11]来鉴定SEP纯度，sugar KS-805串联KS-802色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为双蒸水，样品浓度为10.0 mg/ml，进样量20 mu;l，流速1.0 ml/min，柱温50℃，记录样品色谱曲线。

预期试验流程：

1海胆黄粗多糖中试提取工艺建立及优化

（1）海胆黄预处理、提取及浓缩

①丙酮脱脂：将新鲜的海胆切开，小心剥离海胆黄（尽量避免打入杂质）并用水漂洗干净，用纱布过滤以尽可能将海胆黄中的水分除去，将收集到的海胆黄置于烧杯中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30 min,弃上层丙酮，反复数次至丙酮层基本无色为止（约6 ~ 8次），最后将丙酮减压挥干。得到的海胆黄丙酮粉样品保存于中国药科大学生命科学与技术学院微生物教研室。②提取及浓缩：称取海胆黄丙酮粉（-40 ℃保存，公司冷库保存）80.95 kg，投入1000 L搪瓷釜中，加10倍体积的纯化水。搪瓷釜的夹套升温至90℃，并维持在90 plusmn; 2℃，搅拌提取6 h。将釜内料液放入1000 L的布氏漏斗内，抽滤得到滤饼再加入到1000 L釜内继续水提6 h，反复共提取三次。每次得到滤液抽入另一1000 L釜内，控制温度在55℃以下，减压浓缩，每次滤液浓缩至原体积的五分之一，最后合并浓缩液待用。

（2）酶解-Sevag法联用除蛋白