细胞色素氧化酶Bmt V的诱导表达与纯化工艺研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一.实验背景

作为自然界最万能的生物催化剂之一的细胞色素 P450 酶，广泛存在于哺乳动物、鱼类、软体动物、昆虫、植物、细菌、真菌、寄生虫、酵母等多种生物体内，并组成了自然界生物催化剂中的一个功能独特的超家族。P450 酶能够参与到生物体内包括内源性物质的合成、外源性物质的代谢解毒与代谢活化等在内的诸多反应中，实现生物体内环境稳定与平衡的调节，此类酶对生物体有着十分重要的意义。在生物体内 P450 酶能够通过活化氧气分子，进而把氧气分子中的一个氧原子转移到底物分子上，从而被称作生物体内的一种重要的单加氧酶。P450 酶能够参与的催化氧化反应包括：C-H 键的羟基化反应、C=C 双键的环氧化反应、N-去烷基化反应、O-去烷基化反应、芳烃的羟基化反应以及杂原子的氧化反应等。除此催化氧化作用外， P450酶将会其在生物体所处内环境的不同，能够发挥出其它不同的催化作用，参与到不同类型的反应之中。例如，C-X(卤素)键的还原性脱卤反应、醛的还原反应、酮的还原反应、氮氧化物的还原反应等。目前，已有大量的实验和理论研究工作投入到如上所述反应的机理研究中。虽然这些研究结果使得我们对很多反应机理有了清晰的认识，但对于有些反应的机理还尚不明确，需要进一步探究和完善^{【1】【6】【7】【8】【9】}。

在 1925 年，Keilin 首次命名了细胞色素（Cytochrome），随后，国际生物化学学会酶委员会对细胞色素作出了严格的定义——细胞色素是一种血红蛋白，其基本生物功能是通过分子中所含血红素铁的价态的可逆变化，从而在生物体内起到传递电子和质子的作用。依据结构，可将人体细胞色素分为 a，b，c 三类。隶属于b类的细胞色素P450酶（CYP450），最初是由Klingenberg和Garfinkel在哺乳动物的肝脏微粒体中发现的，是因其还原态与一氧化碳结合后，在450nm 处存在吸收峰，而Omura和Sato于1964年证明这种与一氧化碳结合的染料分子具有血红蛋白的属性，因而首次在文献中建议将此蛋白称为细胞色素P450^【2】。P450 酶在生物体内存在膜结合和可溶性两种形态，主要分布于内质网、微粒体内膜上。尽管所有的细胞色素P450酶的折叠结构高度保守，但不同亚型的二级结构的精确位置却存在差异，从而保证了不同亚型的 P450 酶的催化代谢底物谱不尽相同。一般来说，离血红素越近的结构保守性越高^{【3】【10】【11】【12】【13】}。

Gunsalus于 1975 年在假单胞菌中发现了可溶性的、能催化樟脑进行羟化反应的 P450（P450cam），而 Poulos 等人对其进行分离纯化，获得了首个P450 晶体，且利用 X-射线衍射法将此晶体结构测定出来了。在此类亚铁血红素-硫醇盐蛋白酶的核心结构是一个三价铁卟啉，其中，铁除了与卟啉的四个氮原子进行配位外，还在垂直于卟啉平面的轴向方向与一个半胱氨酸的硫原子相连的，虽然该核心结构深埋于酶的内部，但却是 P450 酶发挥催化活性的关键区域。P450 酶家族蛋白的晶体结构不断被解析出来，使得研究该家族酶的生物、化学性质成为可能。截至目前，已有大量的实验和理论研究报道^【4】。

二．实验目的与意义

对细胞色素P450催化反应机理的研究可以使我们更深刻的认识这些生理过程，从而可以进一步对生理活动进行调控，使其的有利于我们的一面得到发展和应用，不利的一面得到抑制甚至排除。P450不仅能降解化合物以获得碳源，而且还参与解毒外源物以及合成具有生物活性的内源物，如甾醇、前列腺素、和花生四烯酸脂等。由于底物经P450代谢后，产物的水溶性大大提高，因此P450 可用于处理环境有毒物质，如多芳烃和碳氟化合物。P450也被用于基因治疗以补偿重要代谢通道的缺损，如补偿CYP21 或CYP17 这些在甾醇合成中起重要作用的蛋白。另外，P450可被用于需要高立体和区域选择性的反应中，如将花生四烯酸转化为 14,15-EET，这一物质的活性在调节K ，Ca² 离子注入肾脏的过程中起着重要的作用。而我们对这些过程如果了解透彻的话，就可以进一步增强这些有利于我们的功能，从而改善我们的生活质量^{【5】【14】【15】}。

细胞色素P450 催化反应的机理的研究对制药行业有着重大的意义。相对于人体来说，绝大部分药物都是异源体，最终都不能存在于人体内，必于通过降解和排泄从人体内消失。人体肝脏内的细胞色素，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6 和CYP3A4 能够代谢临床上的gt;90%的药物。正如Brodie和他的同事阐述的，“在没有弄清楚这些外源物（药物）代谢的生化反应机理之前，我们的大部分药物治疗方案将会是很危险并且是很不可行的！因为绝大部分药物的作用有很长的潜伏期，因此彻底地了解这些药物降解的生化机制显得尤为重要！

当然在有限的毕业实习的时间里，我只能调整自己的实验内容，只能完成细胞色素P450氧化还原酶研究的前期工作，那就是BmtV酶在大肠杆菌中的可溶表达与分离纯化工艺的研究，这部分工作是后续研究的前提，具有很重要的意义。

三.实验内容