开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题背景
环磷酸鸟苷-单磷酸腺苷（cGAMP）合酶（cGAS）—干扰素（IFN）基因刺激因子（cGAS-STING）通路，通过识别胞浆DNA，触发炎症相关基因，如IFN基因的表达，引发炎症反应。这一通路在病毒细菌感染、多种机体炎症反应、肿瘤免疫反应、自身免疫疾病中均有参与。而cGAS-STING通路被证明在肿瘤免疫中发挥重要作用，STING通路可诱导Ⅰ型干扰素IFN表达，诱导DC细胞成熟、呈递抗原，促进T细胞活化，还可活化CD8 T细胞与NK细胞、增加其分泌IFN-gamma;与肿瘤坏死因子TNF等一系列细胞毒性相关因子的潜力，因此cGAS-STING通路激活剂自身具有抗肿瘤免疫治疗效果。同时研究表明，其还可增强与之联用的传统抗肿瘤免疫疗法。
而近年对于多链霉菌菌株发酵液提取物的研究，也发现了一些微生物次级代谢产物的细胞毒性或抗炎症性质，有着较高的深入研究与市场价值[1, 2]。化合物MT196作为课题组从链霉菌的发酵液中分离得到的全新次级代谢产物，在初次筛选中展现出了颇佳的抗肿瘤活性。但MT196对于肿瘤细胞的杀伤作用及其对cGAS-STING通路的作用尚不清楚。因此该课题将通过观察化合物MT196对多种肿瘤细胞株的生长抑制作用，在MEF细胞上通过q-PCR, Western blot和ELISA观察化合物对cGAS-STING通路的激活作用，以此对MT196化合物于cGAS-STING通路的刺激作用与效果进行初步探索与评估，为未来cGAS-STING通路相关药物的研究提供实验数据基础。
- 拟解决问题
利用CCK8试剂盒检测肿瘤细胞株与MT196化合物共孵育后细胞活力，评估MT196对于肿瘤生长抑制作用，通过q-PCR、Western blot、ELISA方法，从转录水平、表达水平上对于通路进行检测，初步探究化合物MT196对cGAS-STING通路的激活作用。
- 可行性分析
对于MT196抑制肿瘤生长的检测，使用了Cell Counting Kit-8（CCK8），作为一种广泛应用的基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）的细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。类似于MTT染色法，WST-8在电子载体存在的情况下，被线粒体中脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物，并通过颜色深浅正比反应细胞活性。相比MTT法，CCK8对细胞的毒性小、灵敏度高、重复性高、操作方便。可有效反映肿瘤活性，并利于肿瘤细胞的回收，以便进行下一步实验。
而对于cGAS-STING通路激活的检测，则在与不同浓度MT196共孵育不等时间的小鼠成纤维细胞MEF上，首先选择使用q-PCR对该通路常见的免疫细胞表达的细胞增殖抑制蛋白干扰素b、炎症趋化因子CXCL1、常由巨噬细胞表达的细胞毒素肿瘤坏死因子等相关基因，进行转录水平的评估，初步证明MT196对于cGAS-STING通路的激活作用。随后使用蛋白印迹（Western blot）法对cGAS-STING通路中的STING、TBK1、IRF3、及其磷酸化激活形式进行表达水平的定性检测，并以beta;-actin蛋白作为内参。最终对干扰素IFN-beta;使用酶连免疫吸附剂检测（ELISA），定量评估不同浓度MT196与MEF共孵育不同时间后，对于固有免疫的激活作用。q-PCR、Western blot与ELISA作为成熟的检测方式，有着便捷、高复现、毒性小、灵敏度高的优点，常作为基因转录与翻译水平定性、定量的检测评估方式。
近年，对于肿瘤与cGAS-STING通路的研究正如火如荼地进行，从该通路的结构，对于DNA识别到利用这一免疫通路进行抗炎抗肿瘤的治疗，已有充足的文献累积，同时肿瘤细胞与MEF的培养与共孵育方法与技术已相当成熟，为该实验的设计提供了可靠可行可重复的方案，同时研究方法也愈趋成熟，实验数据评估指标的获取方便结果准确，因此实验的可行性较高。
- 研究内容
1.CCK8检测化合物MT196对多种肿瘤细胞株的增殖抑制作用。
2.q-PCR和Western Blot检测化合物对cGAS-STING通路的激活作用
- 工作计划
2022.03 了解课题内容、查阅文献资料、撰写开题报告；
