白色念珠菌作为一种无害共生菌，无症状地占据体内几个生态位，与微生物群其他成员和谐共存。然而，由于局部环境变化、抗生素的使用或免疫系统改变而扰乱这种平衡时可使白色念珠菌迅速增殖并引起感染，是医院获得性感染的主要原因，临床上40%的血液感染疾病由白色念珠菌引起。在口腔和阴道上皮等粘膜以及植入医疗设备表面形成高度结构化的生物膜是白色念珠菌引起院内感染的主要毒力属性之一[1]。生物膜被认为是念珠菌细胞最常见的生长形式，也是增强抗真菌药物耐药性的强效致病因子[2]，它本质上作为病原体细胞的储存库，对传统的抗真菌疗法、宿主免疫系统和其他环境因素具有高度抵抗力，并有可能导致种子播散性血流感染[1]。
白色念珠菌生物膜形成过程分为四个不同的阶段，最初（0到2小时），大多数白色念珠菌细胞以芽生孢子的形式出现，与固体表面接触时启动粘附，形成基底层固定的酵母细胞。在3至4小时，固体表面出现明显的微菌落。中期发育阶段（12至14小时）出现了以非细胞物质为主的结构，其表现为覆盖真菌微菌落的雾状薄膜，主要由细胞壁样多糖组成。在成熟阶段，一个由多层多态性细胞组成的复杂网络逐渐形成，菌丝细胞、假菌丝细胞和圆形酵母细胞同时被包裹在细胞外基质中，使生物膜呈现出厚重而结构化的外观；最后阶段为扩散阶段，一些圆形的酵母细胞从生物膜中分散到新的种子点，从而完成扩散。[3]
在正常的杀菌浓度下，常用的抗真菌药物唑类、多烯类和棘白菌素对生物膜中的白色念珠菌细胞基本无效，尽管高浓度抗生素可以对抗生物膜，但这些剂量通常会造成白色念珠菌严重的耐药性[4]。事实上，自从棘白菌素问世10多年以来，还没有新的抗真菌药物问世，因此迫切需要新的治疗方法来对抗真菌感染。[5]
迄今为止已经确定了50个转录调节因子和101个在生物膜形成中具有功能验证作用的非调节基因。Adh1（乙醇脱氢酶I）由白色念珠菌中的ADH1基因编码，是代谢中的关键酶之一，当糖酵解产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳时，乙醛被Adh1还原为乙醇，该还原步骤也被酵母细胞用来再生NAD 。因此，ADH1表达升高是通过丙酮酸旁路途径的念珠菌代谢通量的指标，[6]并且乙醇和乙醛的转化也是产生能量的糖酵解连续性的先决条件[7]。
Yanjun Song等人[7]发现ADH1缺失突变体致病性减弱，其可能的原因为ADH1的缺失增加了乙醛的产生并抑制了白念珠菌线粒体氧化磷酸化和菌丝形成，由于细胞内ATP含量降低，cAMP-PKA信号通路受到抑制并最终抑制了与白念珠菌致病性有关的多种毒力因子。另外，Pranab K. Mukherjee等人[4]通过蛋白质组学、Western和Northern印迹分析发现，由ADH1突变菌株形成的生物膜，其产生的乙醇量明显少于由亲本和回复突变菌株形成的生物膜，但乙醛量的变化与之相反，这表明Adh1对生物膜形成的影响由其酶活性特异性介导，Adh1有助于白念珠菌在体内外形成生物膜，并通过乙醇依赖机制限制生物膜的形成。
白色念珠菌的另一潜在毒力因子为细胞外水解酶，除自身可产生蛋白水解酶外，白念珠菌还利用哺乳动物宿主的纤维蛋白水解系统，这种对纤溶酶原的捕获可能与病原体和宿主之间的主要界面，即细胞壁的成分相关。蛋白质组学分析表明，Adh1是白色念珠菌中负责大多数纤溶酶原结合的高亲和力蛋白质之一，其通过羧基末端的赖氨酸残基参与这种结合，随后，结合型纤溶酶原可被哺乳动物纤溶酶原激活剂激活为纤溶酶，并可能增加致病真菌的组织侵袭和坏死能力。[8]
综上所述，乙醇脱氢酶Adh1被确定为一种过敏原和抗原，[9]在细胞质中参与代谢作用，并作为一种粘附素位于细胞壁上，与宿主的纤维连接蛋白和血清纤溶酶原结合。另外，也有研究表明，Adh1与促进癌症有关[10]。因此，基于白色念珠菌Adh1作用的多样性及人类和真菌Adh1之间的较低同源性（32%），该蛋白被认为是抗真菌疗法的一个潜在靶标。[5]
蒽醌是一类具有广泛药理活性的化合物，其药理作用包括抗高血压，抗癌，抗炎，抗真菌，抗病毒，神经保护，酶抑制剂等。据报道，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、红紫素、1, 3-二羟基-2-甲基蒽醌和1, 8-二羟基-2-甲基-3, 7-二甲氧基蒽醌对白色念珠菌具有抗真菌活性，且蒽醌化合物也是抑制白色念珠菌生物膜形成的潜在分子库，对于治疗由白色念珠菌生物膜引起的反复感染具有重要作用。11前期实验中，我们将白色念珠菌与2-羟基蒽醌在96孔板内共培养24h后通过结晶紫染色发现，与空白对照相比，2-羟基蒽醌具有显著抑制白色念珠菌生物膜形成的能力。为了探究2-羟基蒽醌对生物膜形成的抑制作用机制，我们分别对对照组与给药组白色念珠菌的转录水平进行了检测，实验结果表明，在2-羟基蒽醌的作用下，细胞内ADH1的转录水平与空白对照组相比具有显著差异。因此，本课题拟在前期研究成果的基础上进一步通过蛋白亲和色谱、液相色谱-质谱联用的方式寻找2-羟基蒽醌在白色念珠菌内发生相互作用的潜在靶点蛋白，探究Adh1是否可能为2-羟基蒽醌抑制生物膜形成的靶点之一；考察在生物膜形成不同阶段2-羟基蒽醌的抑制效应，以及在不同浓度药物作用下白色念珠菌内Adh1水平的变化，确定药物是否会对Adh1的胞内含量产生影响及有效作用浓度与时间；通过RNAi的方式下调白色念珠菌内Adh1的水平，验证ADH1在白色念珠菌生物膜形成过程中的作用，并进一步探索Adh1作为2-羟基蒽醌作用靶点的可能性，为白色念珠菌生物膜形成机制以及治疗药物设计的深入研究提供参考。
参考文献：
[1] Gulati M, Nobile C J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms[J]. Microbes and infection, 2016, 18(5): 310-321.
