- 课题背景
肿瘤乏氧是恶性实体瘤发展过程中形成的一个重要的微环境，处于乏氧环境中的肿瘤细胞对传统的化疗、放疗及光动力治疗等具有明显的抗性，并成为肿瘤恶化、转移等不良预后的重要指标.肿瘤细胞在乏氧状态下可以通过自身某些内源性基因表达的变化来适应其赖于生长的微环境。目前已知这些内源性基因包括有乏氧诱导因子一(Hy-poxiainducedfactor-1, HIF-1 )肿瘤内乏氧成像可以为临床判断肿瘤预后和采用干预措施提供依据，靶向乏氧肿瘤治疗可以克服传统肿瘤治疗中遇到的抗性问题，对临床防治乏氧、增强机体代偿适应能力都有重要意义.此外，乏氧还与肿瘤对化疗和放疗的耐药直接相关。因此，对肿瘤乏氧的成像与测量对于癌症的诊断和治疗极为重要。在肿瘤乏氧检测中光学成像也是应用最为普遍的方法，有关肿瘤乏氧光学成像的探针研究一直是肿瘤乏氧检测研究的热点.肿瘤乏氧探针的设计主要基于的原理:依靠肿瘤乏氧区域的强还原性及探针荧光的氧气依赖性
近年来荧光纳米颗粒在生物医学的应用方面发挥着越来越重要的作用，金纳米粒子在生物医学领域内有广泛的应用因其表面易被修饰，并且具有光学物理特性可以用作荧光探针，金纳米也是一种极佳的淬灭剂，在荧光能量共振转移(fluorescence resonance transfer, FRET)中可以代替传统的淬灭剂。
分子信标是基于荧光共振能量转移(FRET)而设计的核酸探针，由茎序列和一段与靶序列相互补的环序列组成，该发卡型序列的5lsquo;端与3lsquo;端分别与荧光染料FTIC和巯基通过化学键相结合.处于自由状态时，发卡结构中的荧光基团FITC和淬灭剂金纳米粒由于茎部序列的互补配对状态而靠得很近，FITC荧光被摩尔消光系数极高的淬灭剂金纳米所淬灭，此时荧光背景几乎为零;当存在靶序列时，分子信标中环序列与靶序列特异性结合，形成相对刚性并比分子信标茎部结构更稳定的双链体，茎部互补链打开，从而使荧光基团FITC与淬灭剂金纳米空间距离激增，金纳米对荧光基团FITC的荧光碎灭作用失效，荧光基团荧光恢复以供检测.同时，荧光强度与细胞内靶序列的含量成正比，故该金纳米荧光分子信标可用于定量检测.更值得一提的是，该分子信标继承金纳米优越的生物相容性，即无需借助载体即可进人细胞，同时，该分子信标生物稳定性高、操作简便、特异性强、可对核酸进行实时测定。
- 要解决的问题
- 形貌可控、粒径均一、单分散的金纳米粒子的合成。研究发现小粒径的金纳米粒子，研究表明，金纳米分子信标通过内吞作用进入细胞后会先进入胞内体，再由胞内体释放至胞浆中进入细胞。所以我首要解决的问题是合成小粒径球形的金纳米粒子。
- 金纳米分子信标的制备，采用生物学信息方法在网络数据库中筛选出针对乏氧诱导因子HIF-1mRNA特异的核酸探针序列，经过修饰后与金纳米构建成纳米分子信标。
- 金纳米分子信标的灵敏性和特异性,稳定性及细胞毒性，并考虑其在活体瘤中的应用，这是在确定分子信标可以检测目标序列的基础上所进行的进一步分析研究。
- 可行性分析
金纳米材料的形貌、尺寸和制备方法的差异会引起性质上的很大不同。研究者们对反应过程进行了研究，改进实验过程中的实验条件、采用不同的还原剂和保护剂等方法实现了金纳米颗粒的可控制备，我通过文献查找，得到了一些合成小粒径球形金纳米粒子的方法。
近年来，金纳米标记技术在各领域己得到广泛的应用。由于金纳米颗粒与生物大分子表面相结合的亲和力，可根据实验需要构建各种类型的探针。金纳米还具有制备过程简单、用量和被检测样木的用量极少、成木低等优点。近年来，荧光纳米颗粒在生物医学的应用方面发挥着越来越重要的作用。有文献报道，纳米金探针组成的分子信标检测单个碱基错配的效率是一般分子信标的8倍，灵敏度是一般分子信标的100倍，所以具有较好的研究前景。
- 研究方法和内容
- 寡核背酸序列的设计.在NCBI(美国国立生物技术信息中心)(http: //www.ncbi.nlm.nih. gov/guide/)中查询HIF-1 mRNA序列，并利用在线BLAST服务器和RNAstructure软件筛选和设计出HIF信标特异性寡核苷酸序列
- 通过柠檬酸钠还原法在水相中制备15nm金纳米粒。扫描紫外可见光谱并利用透射电子显微镜对金纳米粒进行表征。并测定其在不同PH下的稳定性，并且研究反应过程中反应条件对纳米粒子粒径的影响。
- 构建发卡型金纳米分子信标，将经过巯基修饰后的寡聚核苷酸序列活化后与金纳米构建成纳米分子信标，用紫外分光光度计和透射电子显微镜进行表征。
- 对制备好的分子信标进行稳定性实验，温度是影响其稳定性的主要因素，特异性和灵敏性实验在细胞实验成功的基础上，可以考虑将药物用于患瘤小鼠的治疗，观察金纳米分子信标在体内的测定效果。
- 工作计划
2月26日—3月9日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。
3月10日—5月10日：金纳米分子信标的制备、对肿瘤细胞乏氧情况的测定等工作。
5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。
5月21日—6月03日：完成毕业论文的评阅与修改工作。
