开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
光动力疗法（PDT）已经成为一种有效的肿瘤治疗手段[1-3]。 PDT将从辐射中吸收的能量传递给氧气，三线态氧气接受能量后被激发，电子跃迁，变成具有毒性可以杀死肿瘤细胞的一种活性氧，单线态氧。这种癌症的治疗方式具有许多治疗优势，包括时空选择性，尽量小的毒副作用，不存在的固有抗性机制，无创性和良好的安全性，以及许多其他独特的功能。然而，肿瘤微环境中典型的缺氧表型严重限制了PDT的治疗效率，而对于PDT的氧气补充策略由于肿瘤的复杂性和异质性始终未能达到理想的肿瘤治疗效果。为了克服肿瘤缺氧环境造成的影响，应考虑将氧气增强的PDT与在产生ROS细胞毒性上具有同源性的疗法相结合，作为增强PDT且不影响其固有特性的策略，以便获得更强有效的治疗结果。
铁凋亡是一种依赖于铁的非凋亡形式的程序性细胞死亡过程，该过程通过Fenton反应，使肿瘤中的过量得过氧化氢和铁反应生成羟基自由基[4-6]。羟基自由基（·OH）是另一种活性氧，能够氧化多不饱和脂肪酸（PUFA），从而产生损害细胞结构和完整性的脂质过氧化物（LPO）。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是脂质修复酶，负责抵抗LPO的细胞毒性并维持膜脂质双层的稳态，而某些诱导剂或启动子可以直接或间接使GPX4失活，促进LPO的积累并导致随后的铁凋亡。铁凋亡的ROS细胞毒性与PDT极为相似，两种同源ROS产生疗法都绕过了细胞凋亡途径，并增强了对多药耐药性（MDR）的逃避，导致内在耐药性的缓解。所以本研究考虑将两种疗法联合。
SLC7A11和SLC3A2（胱氨酸/谷氨酸转运蛋白）负责维持细胞抗氧化环境并防止在铁凋亡产生ROS。在之前的研究中，曾报道过淋巴细胞分泌的IFN-gamma;下调了SLC7A11和SLC3A2，并且两者的低表达会使癌细胞对铁凋亡更加敏感。此外，还有报道指出，通过PDT治疗，更多数目的淋巴细胞浸润进入肿瘤部位，刺激了IFN-gamma;在肿瘤部位分泌的增加。因此，据推测，PDT能够降低SLC7A11和SLC3A2的表达，从而进一步促进肿瘤细胞的铁凋亡。并且，考虑到它们在ROS细胞毒性产生机制的确切同源性，铁凋亡产生的羟基自由基又弥补了PDT在肿瘤乏氧环境下效果的不足，相互促进的PDT和铁凋亡之间的联合治疗可能是一种有前景的癌症治疗策略。
血红蛋白（Hb）是一种已经被广泛研究的生物内源性蛋白，由于其优越的氧负载特性，经常在PDT中充当供氧剂[7-10]。Hb结合氧气的功能由其中螯合的二价铁实现，该铁也曾在铁凋亡治疗中用作补铁剂[7]。因此，Hb在构建联合铁凋亡和PDT治疗二合一纳米平台中是非常理想的候选基底，本研究拟基于血红蛋白设计纳米平台同时为PDT补充氧气和为铁凋亡治疗补充铁。二氢卟吩e6（Ce6）（（7S，8S）-7-（2-羧乙基）-5-（羧甲基）-18-乙基-2,8,12,17-四甲基-13 -乙烯基7H，8H-卟啉-3-羧酸），一种具有竞争力的带有羧基的疏水性光敏剂[9, 11-13]，本研究计划将其与亲水性Hb通过形成酰胺键连接，从而形成具有以下特征的两亲性Hb-Ce6单体：触发PDT的同时协同补充氧气。
当仅向细胞提供有限的铁时，对于铁凋亡的诱导来说量是不足的。据报道，当与充分的铁源共存时，索拉菲尼（SRF）是一种疏水性的铁凋亡的促进剂，可以直接抑制谷氨酸-胱氨酸逆转运系统xc-，并间接失活GPX4，从而导致强效的铁凋亡. 故本研究拟将SRF载入由两亲Hb-Ce6自组装的纳米粒子中，制备2合1纳米平台SRF@Hb-Ce6，以诱导强效铁凋亡和补氧的PDT。为了防止体内药物运输过程中的药物泄漏，增强药物在肿瘤部位的释放特异性，本研究还拟将两亲的基质金属蛋白酶2（MMP2，一种在肿瘤组织中高度表达的蛋白）响应肽嵌入胶束的骨架中，以确保特异性通过响应肿瘤部位高表达的MMP2使胶束分解在肿瘤部位释放SRF[14-17].
在本研究中，二合一的纳米平台的构建通过将Ce6和血红蛋白以酰胺键进性连接，其次载入索拉菲尼和混入MMP2响应性肽完成，随后，对于该纳米平台的表征，我们首先需要确证两者的成功连接。Ce6分子量较小，可通过透析除去。在合成完毕后，透析除去Ce6，余下的溶液经紫外检测，如果仍然有Ce6的特征吸收，则可说明Ce6成功连接到血红蛋白。之后，为观察纳米平台的形成，透射电镜拍照，DLS测粒径。探究纳米平台的载药能力，计算包封率。通过在溶液中加入纯化的MMP2，在投射电镜下观察其形貌的变化和用DLS检测其粒径的变化来判断响应性，最后通过高效液相检测索拉菲尼的特异性释放，并用共聚焦显微镜观察。
在对纳米平台的合成和表征结束后，将进一步探究该纳米平台对于光动力治疗的增幅效果。因在这里只为探究平台对于光动力治疗的增幅，故不将索拉菲尼载入其中。 在此之前，需要检测该平
台中血红蛋白的补氧能力在经过一系列化学合成的过程后是否收到影响。取密闭容器，在液面上封加液体石蜡保证液体气体环境稳定进性实验，利用氧分压仪进性检测。光动力治疗产生的单线态氧可由DCFH-DA探针检测，在进性细胞培养后，加入探针和相应药物进性孵育和后续处理，一段时间后进性光照用共聚焦显微镜和流式细胞仪进行观察。
铁凋亡的效果可检测对应的标志物，GSH的减少，MDA的增多，LPO的积累，GPX4的失活等。由于这里只探究纳米平台对铁凋亡的诱导，故在这项探究中不引入光照的辐射。在这些研究的基础上，拟继续加入铁死亡抑制剂和去铁氨进行进一步的探究，通过观察研究铁死亡被理论抑制后铁死亡标志物的变化来最终断定纳米平台对铁凋亡的强势诱导。同时，由于索拉菲尼实际上是一款肝癌的酪氨酸激酶靶向药物，故主要会引起凋亡，为区分纳米平台中SRF协同于铁发挥的诱导铁凋亡作用和单独SRF本身发挥的凋亡诱导作用，又通过加入凋亡抑制剂和铁凋亡抑制剂来观察两者对于细胞活性的相对影响。
