开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
肺炎支原体（M.pneumonia）是引起SARS的主要病原体之一。肺炎支原体引起的病理改变主要为间质性肺炎，也可并发支气管肺炎。这种疾病称为原发性非典型肺炎。学龄前和学龄儿童是易感人群，社区获得性肺炎在感染后很常见。近年来，重症难治肺炎支原体肺炎的报道越来越多，耐药菌株的出现使治疗困难。除呼吸道疾病外，肺炎支原体感染还可引起神经系统和消化系统疾病等并发症[1]。此外，肺炎支原体可逃避体内宿主免疫系统的清除，导致持续性感染，导致机体器官的慢性病理损伤，与动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发生发展密切相关。因此，对肺炎支原体的研究越来越受到重视[2]。
因此，本人的毕业论文（设计）拟通过在几个肺炎支原体外膜蛋白中筛选抗原特异性抗原表位，利用基因工程技术表达制备含抗原特异性抗原表位的蛋白片段，纯化获得高纯度、特异性好、抗原性强的的重组蛋白，为研制疫苗及检测试剂等奠定基础，具有重要的现实意义。
本次设计主要采用的研究手段主要分为以下四个方面：第一步，利用计算机进行分析，筛选出肺炎支原体外膜蛋白中筛选抗原特异性抗原表位；然后，利用基因工程技术，构建出表达抗原特异性抗原表位的工程菌，优化其表达条件；接着，建立一个纯化抗原特异性抗原表位的技术路线，从而纯化获得高纯度的表达蛋白；最后，对纯化出的抗原特异性抗原表位的纯度分析及抗原性分析。
本次设计预期能够达到下面这几个研究成果：首先，获得高效表达抗原特异性抗原表位的工程菌；其次，表达蛋白的纯化工艺稳定，以获得高纯度的表达抗原特异性抗原表位；最重要的，特异性抗原表位的抗原性强、特异性好。
文献综述如下：
- 肺炎支原体的结构特点：
肺炎支原体是介于细菌和病毒之间的最小的原核微生物，能在无生命培养基上独立复制和存活[3]。肺炎支原体无细胞壁,外层细胞膜主要由蛋白质和脂类构成，形态多样，丝状等。由于无细胞壁的结构特点，导致其对头孢和青霉素类抗生素耐药。肺炎支原体主要通过细胞膜表面的结构与宿主勒细胞膜上的受体结合，以摄取氨基酸、核酸前体物质、游离脂肪酸等，合成自身结构及营养物质。因此,对宿主细胞和组织的粘附，是其致病的关键。但支原体也会因基因突变而丧失其粘附能力,其毒力也随之丧失[4-6]。
- 目前成果：
目前，Niang[7]等研究证实在肺炎支原体表面存在一种特异性粘附因子。该黏附因子主要由糖蛋白组成，可在肺炎支原体表面形成外膜蛋白。Varshney[8]等研究表明，肺炎支原体P30外膜蛋白具有良好的免疫原性，与病原体的感染和传播密切相关。它是多种肺炎支原体的重要致病因素。肺炎支原体外膜蛋白中的P1蛋白和P30蛋白主要集中在粘附小体的顶端结构，可直接与呼吸道粘膜上皮细胞膜上的神经氨酸受体结合，从而使肺炎支原体粘附在细胞表面[9]。同时，P1蛋白是最主要的粘附蛋白，其中和抗体能很好地防止肺炎支原体粘附于宿主细胞，具有很大的免疫优势。
- 目的基因选择：
本次实验所使用的肺炎支原体融合蛋白，是已由东部战区疾病预防控制中心从利用计算机分析肺炎支原体的P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的氨基酸序列，筛选出含强抗原表位的肺炎支原体的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的肺炎支原体P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的串联基因序列，利用基因工程技术，构建的重组质粒表达肺炎支原体P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的蛋白,在其N端为P116蛋白片段,长206个氨基酸,中间部分为P1蛋白片段,长271个氨基酸,C端为P30蛋白片段,长55个氨基酸,三者之间由氨酸-甘氨酸-丝氨酸三个氨基酸连接，融合蛋白全长538个氨基酸。该融合蛋白可用于疫苗及肺炎支原体抗体或抗原的检测，及用于肺炎支原体单抗和多抗制备等[10]。
- 实验方法：
前述所需工程菌已由东部战区疾控中心构建完毕，所使用的质粒为pGEX-4T-2，转到大肠杆菌（BL21）中，对高表达的肺炎支原体P1融合蛋白的工程菌进行扩大培养，使用IPTG诱导其表达，采用超声波破碎和GST胶结合的方法纯化目的蛋白P1C，并用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，最后采用双抗体夹心法检测目的蛋白P1C的抗原性。IPTG为异丙基 beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷，作为乳糖类似物，不会被工程菌分解，IPTG可以解除阻遏物对 Lac或 Tac启动子，诱导重组蛋白表达。GST法为使用含有还原型谷胱甘肽的琼脂凝胶从诱导表达后的工程菌裂解物中，通过GSH洗脱，直接纯化具有GST标记的目标蛋白质，该方法可以在温和的和非变性的条件下洗脱，保持蛋白质的抗原性和生物活性[11]。SDS-PAGE为常用的鉴定蛋白的方法之一。在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，从而达到鉴定目的蛋白的目[12]。双抗体夹心法是ELISA法的一种，将含有覆膜抗体的血清加入酶标板小孔中，洗涤，加入待测抗原；如果两者特异性结合，多余的抗原就会被清除；加入与待测抗原特异性反应的酶联抗体，形成“夹心”；最后，加入酶的底物。终止反应后，通过观察酶标板小孔的显色情况，可以判断该方法是否建立成果，并通过测定OD值，对该方法的敏感性进行测定。此方法操作简单，结果直观，非常适合用于P1C抗原性的检测。
