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一、研究背景 血管新生是肿瘤生长的基本过程，肿瘤组织通过过度的血管新生保证氧和营养物质向增殖细胞的供应，促进自身的生长和转移。血管新生受到多种促血管生成因子的调节，包括血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素8（IL-8）、血管生成素-Tie受体、ephrin-Eph受体和Delta-Notch途径[1]。其中，血管内皮生长因子（VEGF）是参与血管生成途径的一组关键蛋白，可激活多条下游信号通路，包括 PI3K/AKT/mTOR信号通路、NF-kappa;B信号通路、PLC-gamma;- Raf激酶-MEK- MAPK及ERK信号通路，激活下游血管生成相关基因的表达 [2]。人们在卵巢和甲状腺癌，黑色素瘤，和髓母细胞瘤[3]均发现了VEGF过度激活现象，因此，抑制VEGF/VEGFR通路成为了治疗血管依赖性肿瘤的良好靶点。 开发VEGFR抑制剂前应充分了解VEGF与VEGFR结合的机制，VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子( PlGF )，主要结合3种酪氨酸激酶受体：VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGFR1主要参与炎症的形成。VEGFR2主要表达在血管内皮细胞表面，介导内皮细胞增殖 [4]。VEGFR3 主要介导淋巴管细胞的增殖。其中，VEGFR2是VEGF诱导血管生成信号的主要介导因子，其结构由三部分组成，包括一个Ig样结构域胞外区、一个含有TK结构域的疏水跨膜区和羧基末端尾[3]。VEGF与VEGFR2结合后，引发受体二聚化，随后在细胞内TK结构域与下游信号转导蛋白上的特定酪氨酸残基上进行ATP结合和自磷酸化或转磷酸化，激活下游通路。VEGFR抑制剂通过模拟腺嘌呤结构[5]，占据膜内酪氨酸激酶域的ATP结合位点，竞争性抑制 VEGF 刺激内皮细胞的迁移和增殖，发挥抗肿瘤作用。 VEGFR抑制剂能够促进肿瘤血管正常化，有利于药物渗透。此外，与一些靶向遗传上较不稳定的肿瘤细胞相比开发的药物（如Bcr-Abl抑制剂甲磺酸伊马替尼）相比，VEGFR抑制剂靶向的是遗传上稳定的内皮细胞，不容易引起耐药，且具有较低的脱靶毒性，这些优势使VEGFR抑制剂在临床上得到了广泛的应用。目前上市的小分子抑制剂主要有阿帕替尼、舒尼替尼、索拉非尼[6]等，分别用于胃癌、甲状腺癌、乳腺癌等疾病的晚期治疗。然而，随着临床上不断使用，现有的药物仍有选择性差与耐药等问题。因此，设计并优化出高选择性、不易耐药的新型VEGFR抑制剂尤为重要。 |
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二、拟研究或解决的问题 新型VEGFR抑制剂主要克服现有药物的选择性差和耐药两大问题。造成肿瘤耐药的因素有很多。首先，肿瘤血管的生成受到除VEGF以还受到其他促血管生成因子的调节，专一地阻断VEGF通路可能会引起肿瘤血管生成从VEGF依赖性转向其他信号通路而引起耐药。如在胰腺胰岛肿瘤中转变为FGF2依赖性[6]。此外，在恶性胶质瘤抗血管生成治疗一段时间后，抗血管生成引发的缺氧导致缺氧诱导因子（HIF-1）表达增多并促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤转移[7]，引发耐药。 另外，ABC运输蛋白（如P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白）在肿瘤的耐药问题中也起到了重要作用。它可以将包括抗血管生成药物在内的多种药物排除细胞外，降低细胞内的药物浓度。如 Rlip7 能将舒尼替尼和索拉菲尼转运至胞外[8]，从而介导肾细胞癌对舒尼替尼和索拉非尼的耐药。解决这些问题的方式主要是开发多靶点抑制剂或是新一代的VEGFR2抑制剂，并对药物的非关键基团进行修饰，降低与ABC运输蛋白结合的亲和力从而延缓耐药。 选择性差的问题则与VEGF受体有关，VEGF受体属于酪氨酸激酶超家族，该家族成员广泛参与体内生物信号的传导，具有较强的序列同源性，而抑制剂物结合的ATP结合位点的三维结构较为保守，导致抑制剂针对VEGFR2的选择性较差。可以对酶与抑制剂作用机制的深入研究，利用不同激酶ATP结合区的结构差异，设计出具有高选择性的化合物。 |
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三、研究方案 1、利用有机合成得到设计的化合物，利用核磁及质谱确证结构。 经查阅资料，初步设计出以下合成路线：将4-硝基苯胺、苯胺在双（三氯甲基）碳酸酯的条件下缩合，构建出苯基脲骨架，生成1-（4-硝基苯基）-3-苯基脲。接着三氯化铁的条件下催化氢化，将还原为氨基。然后与4-氯-6,7-二甲氨基喹啉与4-氯-6,7-二甲氨基喹唑啉缩合（可用缩合剂HATU与DIEA，常温反应）。生成目标化合物。通过在原料苯胺不同位点引入不同的取代基，以及分别与喹啉和喹唑啉骨架缩合，可合成V3与V4两大系列化合物。（如图1）
图1.V3、V4系列化合物合成路线 2、尝试对化合物进行相关的细胞或酶学测试，理解所建立的测试方法。 3、结合测试得出的生物学数据为进一步优化出高活性、高选择性的VEGFR2抑制剂提供参考。 |
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四、预期结果 设计并合成出5个具备高活性高选择性的VEGFR2小分子抑制剂，并进行生物活性测试。 |
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五、参考文献 [1]Shibuya Masabumi. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1 and receptor-2 in angiogenesis.[J]. Journal of biochemistry and molecular biology,2006,39(5). [2]Pan Liangli,Liu Chenyang,Kong Yanan,Piao Zhengguo,Cheng Biao. Phentolamine inhibits angiogenesis in vitro: Suppression of proliferation migration and differentiation of human endothelial cells.[J]. Clinical hemorheology and microcirculation,2017,65(1). [3]Shibuya Masabumi. Tyrosine Kinase Receptor Flt/VEGFR Family: Its Characterization Related to Angiogenesis and Cancer.[J]. Genes amp; cancer,2010,1(11). [4]Shibuya Masabumi. Vascular endothelial growth factor and its receptor system: physiological functions in angiogenesis and pathological roles in various diseases.[J]. Journal of biochemistry,2013,153(1). [5]徐畅,姚其正.具有抗肿瘤血管生成作用的VEGFR2抑制剂的研究进展[J].中国抗生素杂志,2018,43(06):654-664. [6]Musumeci Francesca,Radi Marco,Brullo Chiara,Schenone Silvia. Vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors: drugs and new inhibitors.[J]. Journal of medicinal chemistry,2012,55(24). [7]De Palma Michele,Venneri Mary Anna,Galli Rossella,Sergi Sergi Lucia,Politi Letterio S,Sampaolesi Maurilio,Naldini Luigi. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors.[J]. Cancer cell,2005,8(3). [8]Fontanella Caterina,Ongaro Elena,Bolzonello Silvia,Guardascione Michela,Fasola Gianpiero,Aprile Giuseppe. Clinical advances in the development of novel VEGFR2 inhibitors.[J]. Annals of translational medicine,2014,2(12). |
