一、文献综述
肿瘤免疫治疗是指通过激发或增强机体的免疫功能，实现控制和杀伤肿瘤细胞的治疗方法[1]。肿瘤免疫疗法分为主动免疫治疗和被动免疫治疗，其中主动免疫治疗有注射瘤苗，被动免疫治疗有注射抗体、细胞因子、免疫效应细胞等[2]。近年来随着免疫检查点功能和作用机制的不断发现，免疫检查点抑制剂的开发已成为肿瘤免疫治疗领域重要的研究方向[3]。其中，PD-1/PD-L1通路的作用机制已经得到较好阐明，PD-1与其配体PD-L1相互结合后，可以传递共抑制信号，抑制T细胞表面受体（TCR）与肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）的作用，进而降低T细胞的免疫活性，该通路被认为是肿瘤免疫逃逸的重要原因之一[4]。利用单抗或多肽伸入药效口袋，竞争性结合PD-1/PD-L1相互作用的热点残基，从而阻断PD-1/PD-L1免疫抑制通路，可以有效增强免疫反应的正向调节，提高细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应[5]。该方法具有适应症广，有治愈可能，毒副作用相对较小等优点。
在临床上抗体的应用已经较为成熟，但也存在生产成本高，分子量大，免疫原性较强，组织渗透性较差等缺点[6]，而多肽的开发被认为是具有潜力的对于抗体的补充甚至替代方案。多肽药物集合了传统化学药物和蛋白质药物的优点[7]，相较抗体，具有以下优点：用量更少，单位活性更高[7]，分子量小，因而具有更好的组织渗透性，更能有效到达肿瘤核心[8]，可通过糖基化或PEG等修饰降低免疫原性[9-11]，生产成本低等。基于上述优点，多肽药物的开发具有广阔前景。目前以癌细胞、细胞因子、膜受体等为靶点的特异性靶向肽已被用于癌症的诊断和治疗[12-14]。此外，FDA也已批准用于治疗II型糖尿病的GLP-1肽 [15]。
然而多肽也存在如理化性质不稳定(易发生氧化，水解，变性，聚集，沉淀，脱酰胺等反应[16-18])、半衰期一般很短、体内易被快速降解等缺点，这些缺点限制了多肽在肿瘤免疫治疗领域的应用。为了改进多肽的上述缺点，已有的方法主要是改变多肽结构，改善多肽给药的剂型[19]，PEG等修饰[20]，构建融合蛋白[21]等，都产生了一定的效果，但仍具有进一步探究的意义。
计算机辅助药物设计（computer-aided drug design, CADD）是以计算化学和受体学说为基础，通过计算机计算和模拟在三维构象下受体与配体药物的相互作用，以此来分析配体药物与靶向受体的亲和力活性，进而实现改造、优化和筛选候选药物配体目的的药物设计方法[22]。计算机辅助药物设计的流程主要有靶点的鉴定（遗传学、分子生物学和生物信息学）、结构的测定（X射线单晶衍射和核磁共振波谱）、生物测定（分子模拟和计算机绘图）、化学合成（组合化学和模拟肽）、临床试验[23]。计算机辅助药物设计可以减少药物开发过程中的盲目性，提高药物研发效率，并且可以使药物设计更直观、便捷和高效[24]。目前已经有不少基于受体三维构象，借助CADD实现药物改进的成功案例，如靶向HIV-1蛋白酶的配体药物通过CADD改进生物利用度[25，26]，或改进亲和力活性[27]。以及通过CADD分析流感病毒外壳表面的唾液酸酶的三维结构和活性位点，发现了有效的抑制剂[28]。其中，分子对接是CADD的重要工具，有助于配体先导物的筛选、改造和优化。可以通过配体与蛋白质的对接，寻找可能的结合模型，并计算亲和力活性。分子对接的过程主要有：首先选择并构建目标受体和配体药物的三维结构，之后进行分子对接，最后分析结果，选择得分最高的结合模式[29]。总之，CADD为新药研发提供了一种新的思维模式, 凭借其较好的科学性和可行性，将在新药研发的各个阶段得到更广泛的应用[30]。
本实验课题以计算机辅助药物设计为背景，借助分子操作软件平台MOE（molecule operating environment 2018），对通过噬菌体展示技术获得的靶向PD-L1的多肽序列进行性质优化。D型氨基酸为非天然氨基酸，虽然它不是构成蛋白质的基本结构单元，但往往在多肽活性和稳定性中有特殊作用[31]。考虑到D型氨基酸构成的多肽与L型氨基酸构成的多肽在理化性质和生理活性方面可能存在的差异，本实验同时对两种不同手性氨基酸构成的多肽序列进行模拟优化。在MOE中分别通过丙氨酸扫描和氨基酸突变，通过亲和力打分以及分析多肽与PD-L1的相互作用力情况，排序并选择亲和力较优的多肽序列来实现优化多肽靶向PD-L1亲和力的目的。之后在确保较优亲和力的前提下，再次通过丙氨酸扫描和氨基酸突变，改变多肽序列中对亲和力贡献较小的氨基酸，通过疏水性排序来选择水溶性较好的多肽序列，实现原始多肽水溶性的提升。之后又考虑到多肽在临床应用中存在半衰期短、易被代谢、稳定性较差等体内代谢动力学上的缺陷，本实验进一步探究了分别对多肽进行序列两端乙酰化、酰胺化修饰，序列前后加入半胱氨酸后构建环肽[32]，优化多肽的体内代谢动力学性质。
参考文献
[1]. 曹雪涛. 医学免疫学[M]. 2013. 北京：人民卫生出版社，2013
[2]. Ventriglia J, Paciolla I, Pisano C, et al. Immunotherapy in ovarian, endometrial and cervical cancer: state of the art and future perspectives[J]. Cancer Treatment Reviews, 2017: S0305737217301226.
[3]. Pardoll, Drew M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy[J]. Nature Reviews Cancer, 2012, 12 (4):252-264.
