毕业设计（论文）开题报告
课 题 名 称： 清胃散配方颗粒的质量标准研究及指标成分的含量测定
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一、内容 采用HPLC法测定清胃散配方颗粒中多元成分的含量，为清胃散配方颗粒的质量控制评价提供参考。 二、 意义 清胃散为临床常用的清热剂，来源于金·李东垣《兰室秘藏》的《脾胃论》篇，原方由当归身、细黄连、生地黄各三分，牡丹皮五分，升麻一钱组成，用于治疗胃热诸症，如胃火牙痛、口臭、口腔溃疡等。现代研究结果表明清胃散中含有生物碱、苷类、挥发油、有机酸等化学成分，具有抗炎、抗菌、黏膜保护、改善心血管系统、抗癌等药理作用。 清胃散为常用的清热剂，临床多用配方颗粒代替传统汤剂，但市售清胃散配方颗粒缺乏统一的质量评价标准，进而影响临床疗效。目前关于清胃散的质量控制研究中，多采用《中国药典》所规定单味药的单一或少数指标成分进行质量评价，但清胃散中的药效成分尚不明确，仅检测其中一种或几种活性成分不能客观反映复方的整体疗效。 本课题收集了不同厂家、不同批次的黄连、生地黄、牡丹皮、当归、升麻配方颗粒，采用HPLC法建立同时测定清胃散配方颗粒中多元成分含量的方法，为清胃散配方颗粒的质量控制评价提供参考。 |
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填写说明
1.指导教师意见填写对文献综述的评语，对本课题的深度、广度及工作量的意见和对论文结果的预测；
2.所在教研室审查意见包括对指导教师意见的认定和是否同意开题等。
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研究方案和技术路线 |
一 研究方案
二 技术路线 |
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三 实验方案 1.含量测定 制备供试品溶液、对照品溶液。设定色谱条件，进行系统适用性与专属性试验考察，即线性关系、稳定性试验、精密度试验、重复性试验、回收率试验等，并对样品进行含量测定，建立清胃散多个指标成分含量同时测定的方法。 1.1材料 1.1.1仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪（G1312B型二元泵,G1367E型高性能自动进样器，G1316A型柱温箱，G4212B型DAD检测器，G1322A型脱气机）；AX224ZH/E型电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；KQ-1000型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;BPG-9070A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KMS-800Y高速万能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）。 1.1.2 药材、对照品与试剂 清胃散单味药配方颗粒（黄连、生地黄、牡丹皮、当归、升麻）均购自于江阴天江药业有限公司（详见附件二）； 盐酸小檗碱（批号：Y31J9H67024）、芍药苷（批号：X12A8C33672）、丹皮酚（批号：D1619066）、阿魏酸（批号：H27J7L16718）、异阿魏酸（批号：A11M9L61182）均购自上海源叶生物科技有限公司；升麻素苷（批号：lw16052601）、毛蕊花糖苷（批号：lw19010908）均购自南京良韦生物科技有限公司，纯度均ge;98%； 甲醇、乙腈均为色谱纯（Merck Lichrosolv Reag.ph eur），水为纯净水；其他试剂均为分析纯。 1.2.2. 色谱条件 色谱柱：Eclipse-XDB-C18（250 mmtimes;4.6 mm，5 mu;m）； 流动相：水(A)-甲醇(B)； 梯度洗脱（0-10 min，10%-20% B；10-15 min，20%-30% B；15-20 min，30%-45% B；20-25 min，45%-80% B；25-30 min，80%-90%；40~45 min，90%~10%）； 流速：1 mL/min； 柱温：25 ℃； 检测波长：254 nm； 进样量：10 mu;L |
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1.3溶液的制备 1.3.1对照品溶液的制备 分别精密称定适量盐酸小檗碱、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、阿魏酸、异阿魏酸、升麻素苷对照品，用甲醇溶解后，制成浓度分别为90.5，10.0，10.0，20.0，12.0，20.0 mu;g/mL的对照品储备液。等量精密移取上述各对照品储备液适量，加甲醇配成盐酸小檗碱、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、阿魏酸、异阿魏酸、升麻素苷含量分别为11.3，1.3，1.3，2.5，2.5，8.3，8.3 mu;g/mL的混合对照品储备液，备用。 1.3.2供试品溶液的制备 按经典名方剂量分别称取黄连、生地黄、牡丹皮、当归、升麻配方颗粒，调剂制得清胃散配方颗粒，加入350 mL水溶解，即得。 1.4线性关系考察 精密吸取“ 1.3.1 ”项下混合对照品液，按照倍比稀释得到系列浓度对照品储备液，按照“ 1.2 ”项下色谱条件由浓度从低至高进样测定，以峰面积积分值（y）为纵坐标，浓度（x，mu;g/mL）为横坐标，进行线性回归。 1.5 精密度试验 取同一份标准汤剂，按“ 1.2 ”项下色谱条件连续进样6次，考察色谱峰保留时间和色谱峰面积的一致性，计算各色谱峰保留时间的相对标准偏差和色谱峰面积的相对标准偏差，判断仪器是否精密度良好。 1.6稳定性试验 取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按“ 1.2 ”项下色谱条件进样，测定盐酸小檗碱、芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、异阿魏酸、升麻素苷的含量及主要色谱峰的保留时间及色谱峰面积。计算保留时间的相对标准偏差和色谱峰面积的相对标准偏差，判断供试品溶液提取后24 h内是否稳定性良好。 1.7 重复性试验 取供试品粉末6份，按“ 1.3.2 ”项下供试品溶液制备方法，重新制备供试品溶液，按“ 1.2 ”项下色谱条件进样检测，考察各主要色谱峰保留时间和色谱峰面积的一致性，计算保留时间的相对标准偏和色谱峰面积的相对标准偏差，判断此法是否重复性良好。 1.8 加样回收率试验 称取己知含量的样品的粉末6份，精密称定，按各成分在原药材中的含有量分别精密加人等量的各对照品储备液，按“ 1.3.2 ”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算加样回收率。 |
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1.9 建立同时测定清胃散配方颗粒中多元成分的HPLC含量测定法 取“ 1.3 ”项下供试品溶液，按“ 1.2 ”项下色谱条件进样检测，拟测定清胃散配方颗粒中盐酸小檗碱、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、阿魏酸、异阿魏酸、升麻素苷的含量。 2.分析与讨论 根据高效液相色谱法实验的结果，对实验过程中的方法、结果进行分析讨论。 2.1 检测波长的选择 《中华人民共和国药典》2015版一部中黄连中盐酸小檗碱的检测波长为345 nm；生地黄中毛蕊花糖苷的检测波长为334 nm；牡丹皮中丹皮酚的检测波长为274 nm；当归中阿魏酸的检测波长为316 nm；升麻中异阿魏酸的检测波长为316 nm。拟通过实验优选最佳测定波长，或采用多波长测定。 2.2 流动相选择 《中华人民共和国药典》2015版一部中黄连中盐酸小檗碱的含量测定流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液；生地黄中毛蕊花糖苷的含量测定流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液；牡丹皮中丹皮酚的含量测定流动相为甲醇-水；当归中阿魏酸的含量测定流动相为乙腈-0.085%磷酸溶液；升麻中异阿魏酸的含量测定流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液。拟通过实验比较这5种流动相对清胃散中6种指标成分的分离效果，优选合适的流动相。 |
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研究进度 |
2020年1月8日—2020年2月7日 查阅文献，了解清胃散的处方组成、主要化学成分、药理作用、提取工艺及质量控制方法等。 2020年2月7日—2020年2月23日 结合所查阅的文献，完成开题报告和综述，收集样品、购买试剂，作好实验准备。 2020年2月23日—2020年3月中旬 开展研究内容，做好实验记录和进行实验结果分析。 2020年3月中旬—2020年4月初 整理试验数据，总结试验结果，完成实验论文。 |
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特色与创新 |
清胃散为常用的清热剂，临床多用配方颗粒代替传统汤剂，但市售清胃散配方颗粒缺乏统一的质量评价标准，进而影响临床疗效。目前关于清胃散的质量控制研究中，多采用《中国药典》所规定单味药的单一或少数指标成分进行质量评价，但清胃散中的药效成分尚不明确，仅检测其中一种或几种活性成分不能客观反映复方的整体疗效。 本课题收集了不同厂家、不同批次的黄连、生地黄、牡丹皮、当归、升麻配方颗粒，按照清胃散经典名方剂量进行调剂，建立同时测定清胃散配方颗粒中多元成分的HPLC含量测定方法，为清胃散配方颗粒的质量控制评价提供参考。 |
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附：与课题内容相关的文献资料不少于2000字，参考文献不少于10种。
附件：文献综述
清胃散配方颗粒的质量标准研究
及指标成分的含量测定
王霞
摘 要 清胃散是常用的清热剂，临床多用配方颗粒代替传统汤剂。配方颗粒由中药饮片经提取浓缩后制得，具有服用方便、便携易存储等优点，但市售清胃散配方颗粒缺乏统一的质量评价标准，影响临床疗效。本文针对清胃散的处方研究、临床应用、化学成分、药理作用、含量测定和质量评价进行综述，为清胃散配方颗粒的质量控制评价方法的建立提供参考。
关键词 清胃散；配方颗粒；高效液相色谱法；含量测定
Abstract: Qingwei powder is a common temperature-lowering drug. Its dispensing granules, which are concentrated and dried from decoction, are often used clinically in place of traditional decoction. Although dispensing granules can be easily taken and stored, the lack of uniform quality standards imperiled their clinical efficacy. This article summarizes researches on prescription analysis, clinical usage, compounds, efficacy, quantitative analysis and quality evaluation of Qingwei powder. It provides reference for building quality analysis methods on dispensing granules of Qingwei powder.
Key words: Qingwei powder; dispensing granule; HPLC; determination
清胃散为临床常用的清热剂，来源于金·李东垣《兰室秘藏》的《脾胃论》篇，原方由当归身、细黄连、生地黄各三分，牡丹皮五分，升麻一钱组成，用于治疗胃热诸症，如胃火牙痛、口臭、口腔溃疡等。现代研究结果表明清胃散中含有生物碱、苷类、挥发油、有机酸等化学成分，具有抗炎、抗菌、黏膜保护、改善心血管系统、抗癌等药理作用。本文就清胃散的处方研究、临床应用、化学成分、药理作用、含量测定和质量评价等作综述。
- 处方分析及临床应用
清胃散最早出自金·李东垣《兰室秘藏》的《脾胃论》篇，原方组成生地黄、当归身、黄连各三分（黄连如质次更加两分，夏月倍之），牡丹皮五分，升麻一钱。原方用于治疗“因服补胃热药，致使上下牙疼痛不可忍，牵引头脑、满面发热、大痛。足阳明之别络入脑，喜寒恶热，乃足阳明经中热盛而作也。其齿喜冷恶热。” 方中黄连为君，清胃泻火，治胃火牙痛；生地、丹皮共为臣，养阴凉血清虚火，用于阴虚血热证；当归和血，用于血受病者；升麻引药入阳明经，升清治上焦牙痛。高建忠[2]指出，若患者没有热伤阴血，未出现阴虚血热症状，可以不用生地、丹皮、当归。
后世医家在原方基础上进行调整，拓展清胃散的应用范围。如清·王昂在《医方集解》中增加石膏，用于胃中积热重症；清·张璐在《张氏医通》中增加川芎，增加活血止痛功效；清·吴谦在《医宗金鉴》中增加煅石膏和灯心草，治疗胎中有热所致胃火上炎[3]。现代医家将清胃散与其它药物联合运用，治疗口腔疾病，如刘勇[4]使用清胃散加减联合甲硝唑，用于慢性牙周炎的治疗；许云[5]联合康复新液治疗复发性口腔溃疡；董佩佩[6]运用清胃散加减联合青霉素，治疗小儿溃疡性口炎。
- 配方颗粒研究概况
清胃散汤剂煎煮流程繁琐、不利于运输和储存，因此临床常用配方颗粒代替。配方颗粒是将中药饮片通过提取、浓缩、制粒等现代工艺制成的免煎颗粒剂，具有体积小、不易变质、便于运输、便于储存、易于服用等优点，但尚缺乏统一的质量标准，不同厂家生产的配方颗粒质量参次不齐，且与传统汤剂相比，配方颗粒中的有效成分、临床疗效等是否改变仍有待研究[7-8]。
传统汤剂在煎煮过程中，各味药中的成分相互影响，使有效成分的溶出量产生变化，进而影响临床疗效。邵进明[9]等在清胃散合煎颗粒剂和分煎配方颗粒剂中均未检出牡丹皮中的有效成分丹皮酚。张丽艳等[10]比较了当归六黄汤配方颗粒与传统汤剂中盐酸小檗碱含量的变化，结果显示配方颗粒中盐酸小檗碱的含量明显高于传统汤剂。已有文献指出[11-13]，牡丹皮对黄连中盐酸巴马汀和盐酸药根碱的溶出有阻碍作用，对地黄中梓醇的溶出有促进作用，升麻对牡丹皮中阿魏酸和蒿本内酯的溶出有促进作用。
上述研究结果表明，尽管配方颗粒改进了传统汤剂的大多弊端，但与传统汤剂相比，其中成分含量已产生明显差异，亟需统一的质量标准和质量监控体系，以保证临床疗效的稳定。
- 化学成分及药理作用
清胃散中主要活性成分为生物碱、苷类、挥发油、有机酸等，具有抗炎、抗菌、黏膜保护、改善心血管系统、抗癌等药理作用。清胃散复方的药效成分目前尚不明确，下面对清胃散中单味药的化学成分及药理作用进行综述：
- 黄连
黄连中主要含有以小檗碱为主的异喹啉类生物碱、木质素、香豆素、黄铜等化学成分，其中生物碱为黄连的主要活性成分，具有降血糖、降血脂、抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理作用[14]。
- 生地黄
地黄中主要有效成分为梓醇、地黄苷、麦角甾苷、毛蕊花糖苷等，具有止血、促进血细胞再生、抗炎、抗胃溃疡、提高免疫、益智、抗衰老等药理作用[15]。
- 牡丹皮
牡丹皮中主要有效成分为丹皮酚，具有抗菌、抗炎、保护肝脏、镇静、解热、镇痛、解痉等药理作用[16]。
- 当归
当归中的有效成分包括苯酞类、香豆素类、黄酮类、有机酸类等，其中阿魏酸是主要成分，易溶于热水，难溶于冷水，具有抗血栓、改善血液循环等药理作用[17]。
- 升麻
升麻中有效成分为三萜及苷类、酚酸类及其衍生物、色原酮等，药典中以异阿魏酸为指标成分，药理作用包括抗病毒、抗炎、调节神经内分泌等[18-19]。
- 中药复方制剂的含量测定
中药化学成分复杂多样，中药复方制剂具有“多成分、多靶点”的特征。目前关于清胃散的质量控制研究中，多采用《中华人民共和国药典》所规定单味药的单一或少数指标成分进行质量评价，但清胃散中的药效成分尚不明确，仅检测其中一种或几种活性成分不能客观反映复方的整体疗效。因此，符合复方用药特点的含量测定及质量控制方法亟待建立[20]。
- 高效液相色谱技术的应用
高效液相色谱法（HPLC）广泛应用于中药的药原检测、物质基础研究和质量控制[21]。张闯等[22]建立了HPLC法同时测定蛇床子配方颗粒中6种香豆素类成分含量的方法，结果显示花椒毒素与蛇床子素含量较高，且6种成分在一定浓度范围内线性关系良好。张婷婷等[23]通过HPLC法测定山药配方颗粒中尿囊素的剂量，计算该配方颗粒的最大给药剂量。
此外，高效液相色谱技术能够结合指纹图谱技术，通过比较样品与标准品的相似度或共有峰差异，对中药进行质量评价[24-25]。庄岩等[26]测定了10批牛黄清感胶囊的HPLC指纹图谱，标记了17个共有峰，识别出9个已知成分，相似度均大于0.95。张永昕等[27]测定了12批补中益气丸的HPLC指纹图谱，标记出19个共有峰，相似度均大于0.95。高尚等[28]测定了10批止血调经颗粒的HPLC指纹图谱，标记了11个共有峰，识别出3个已知成分，相似度均大于0.95。
上述研究表明，高效液相色谱技术精确度高、稳定性好，可以为配方颗粒的质量评价提供可靠依据，但目前尚无针对清胃散中多元成分的HPLC含量测定研究。下面综述清胃散中单味药的含量研究，以期为清胃散配方颗粒的质量控制提供参考：
- 黄连
杨繁等[29]通过HPLC法，以乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾（ 30:70 ）为流动相，检测波长为345 nm，测定黄连饮片及配方颗粒中盐酸小檗碱的含量，结果显示其中盐酸小檗碱含量分别不少于4.0 %和13.0 %。
- 生地黄
刘基等[30]以乙腈-0. 1%磷酸为流动相，梯度洗脱，检测波长为210 nm，建立了HPLC法同时测定生地黄汤颗粒中11中指标成分含量的方法，11种成分均分离效果良好，且在一定浓度范围内成线性。
- 牡丹皮
夏成凯等[31]收集了9批不同产地的牡丹皮药材，建立了HPLC同时测定牡丹皮中13种成分含量的方法，以乙腈-0.5%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为254 nm，13种成分在测定的浓度范围内线性关系良好。
- 当归
杨蕊菁等[36]收集10个不同产地的当归药材，以0.2%甲酸-乙腈为流动相，梯度洗脱，检测波长为280 nm，建立了HPLC同时测定当归中9种成分含量的方法，结果显示9种成分分离度良好，且不同产地的当归含量差异明显。
- 升麻
蔡晓星等[38]以乙腈-0.01%磷酸为流动相，检测波长为320 nm，建立了测定升麻中咖啡酸、阿魏酸和异阿魏酸含量的HPLC方法，3种成分均在一定范围内线性关系良好。
- 总结
清胃散为常用的清热剂，临床多用配方颗粒代替传统汤剂，但市售清胃散配方颗粒缺乏统一的质量评价标准，进而影响临床疗效。高效液相色谱技术能够测定中药中多元成分的含量，被广泛用于中药质量评价。目前尚无针对清胃散配方颗粒的含量测定研究，本文针对清胃散的处方研究、临床应用、化学成分、药理作用、含量测定和质量评价进行综述，为清胃散配方颗粒的质量控制评价提供参考。
参考文献
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样品统计
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厂家 |
配方颗粒 |
批号 |
数量（袋） |
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江阴天江药业有限公司 |
黄连 |
18111183 |
1 |
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18120513 |
1 |
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1812120 |
1 |
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20190304 |
1 |
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18102408 |
1 |
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当归 |
19010913 |
1 |
|
|
19011933 |
1 |
||
|
19052709 |
1 |
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|
19021306 |
1 |
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180802 |
1 |
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牡丹皮 |
19011603 |
1 |
|
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18100803 |
1 |
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19032102 |
1 |
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18120713 |
1 |
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|
17032918 |
1 |
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地黄 |
18111903 |
1 |
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18120273 |
1 |
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19031510 |
1 |
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|
19040902 |
1 |
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18090520 |
1 |
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升麻 |
18111453 |
1 |
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19010243 |
1 |
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18080904 |
1 |
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|
20190201 |
1 |
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|
18101903 |
1 |
毕业设计（论文）开题报告
课 题 名 称： 清胃散配方颗粒的质量标准研究及指标成分的含量测定
