基于模拟酶放大信号的微小RNA比色检测体系的构建文献综述

课题名称 基于模拟酶放大信号的微小RNA比色检测体系的构建课题性质 radic; 基础研究应用课题 设计型 调研综述 理论研究开题报告一、拟研究或解决的问题微小RNA（microRNA，miRNA），是一种非编码小片段RNA，与多种疾病的病理生理过程密切。 但由于微小RNA具有表达量低、同源性高、结构微小、稳定性较差等特征，因此发展方便、快速、灵敏度高、特异性强的检测方法是十分必要的。 我们试图构建一种基于模拟酶放大信号的微小RNA比色检测体系，并将其运用在疾病的检测中。 二、研究手段1、基于DNA酶与分子马达和G四链体-氯化血红素DNA酶两种模拟酶放大信号构建一种微小RNA的比色检测方法。 2、利用紫外-可见光光度法、Southern blotting法、荧光光度法等方法优化DNA序列与反应条件，完善比色检测方法。 3、体外实验模拟尿液中微小RNA的含量，对比色检测体系性能进行测量。 三、成果形式成果将以基础研究论文的形式呈现。 四、课题进度第一阶段（实习开始至三月初）：查阅相关文献，了解课题背景。 设计实验方案，学习常用实验操作方法。 第二阶段（三月至五月）：初步构建基于两种模拟酶放大信号构建一种微小RNA的比色检测方法。 第三阶段（五月至五月末）结束实验，撰写毕业论文。 五、课题背景1、微小RNA简介微小RNA（microRNA，miRNA），是一种单链的长约18到25的非编码小片段RNA，它广泛存在于真核细胞中，具有高度的保守性[1]。 成熟的微小RNA可以与Argonaute等蛋白形成RNA诱导的沉默复合体，通过与特定mRNA完全或不完全碱基互补配对,从而抑制mRNA翻译或者直接导致mRNA降解，以实现转录后水平的基因表达调控[2]。 微小RNA 通过调节基因的表达，进而参与细胞的增殖、分化、凋亡、代谢及激素分泌、个体发育等体内正常的生物学过程。 不仅如此，大量证据还表明，反常数量的微小RNA表达与病理学过程息息相关，比如肿瘤的发生发展[3]、心脏病[4]、神经性疾病[5]、肾损伤[6]等密切相关，可以作为一个潜在的治疗靶点以及疾病诊断与治疗的生物标志物[7]。 但是由于微小RNA具有表达量低、同源性高、结构微小、稳定性较差等特征，因此发展方便、快速、灵敏度高、特异性强的检测方法是十分必要的。 2、微小RNA现有检测方法传统的已经广泛应用的微小RNA的检测方法有Northern blotting法、微阵列法、定量-逆转录PCR法等。 Northern blotting法是最早用于微小RNA检测的方法，其主要原理是将标记的与目标微小RNA互补的DNA 探针杂交到硝酸纤维素膜上，然后显影检测。 但仍然存在很多问题，如所需样本量较大（约10-30mu;g)、检测时间长、通量低、灵敏度低（检测限为纳摩尔级别)等[8]。 微阵列法属于高通量检测方法，可同时定量检测多个微小RNA的表达量。 通过将与微小RNA序列互补配对的探针固定制备芯片，与微小RNA杂交后获得信号达到高通量检测微小RNA。 但是该方法同样灵敏度低、特异性差，而且探针制备的费用高[9]。 定量-逆转录PCR法依赖逆转录提高了检测的灵敏度。 但是传统的微小RNA检测方法确实存在操作过程冗长、分析时间长、依赖实验室大型仪器等局限性，极大地限制了微小RNA的实际应用。 最近有科研人员发明了几种微小RNA检测的新方法，比如比色法[10]、荧光法[11]、生物发光法[12]、电化学发光法[13]、质谱法[14]等。 其中比色法检测微小RNA可以达到方便、快速的目的，而且无需大型实验仪器。 3、DNA酶与分子马达放大信号策略DNA除了有储存遗传信息的功能，还可以催化许多反应[15]，比如裂解RNA[16]和DNA[17]，连接DNA[18]和RNA[19]以及DNA磷酸化[20]等，然而仅有一些少数具有特殊结构的DNA序列才拥有这种催化功能。 通过体外筛选而得到的具有RNA裂解功能的DNA酶可以许多领域作为一个常用的工具[21]，具有化学性质稳定、反应高效、选择性好和价廉易得等优点。 DNA酶包括一个小的仅有15个核苷酸长度的催化活性中心，在它两侧各有一条用于底物识别的核苷酸序列臂，可以通过沃森-克里克碱基配对原理特异性地与RNA底物序列结合。 在Mn2 、Pb2 、Mg2 等离子的存在条件下，金属离子可以作为辅因子，通过破坏磷酸二酯键来发挥DNA酶裂解特异RNA底物的功能。 [21]细胞可以利用蛋白马达沿着细胞骨架传递分子和细胞器[22]。 受到蛋白马达的启发，科研人员最近合成了多种DNA马达去模拟蛋白马达的功能。 沃森-克里克碱基配对理论的特异性和可预见性，使得DNA马达有潜力成为一种合成分子马达体系的材料[23, 24]。 有文献报道一种以微小RNA为靶标启动的DNA马达，作者在纳米金上修饰了大量共轭的核苷酸序列和被特定锁链序列锁住的DNA酶。 当有微小RNA存在时，通过链置换反应，微小RNA与锁链序列互补配对结合使得DNA酶脱离锁定。 随后，DNA酶杂交到纳米金上的核苷酸底物序列上，在辅因子存在的条件下发挥裂解RNA的功能。 DNA-RNA之间的裂解，提供了DNA酶从一个底物向下一个底物移动的动力，自动裂解底物序列，起到放大信号的功能[25]。 4、G四链体-氯化血红素DNA酶G四链体-氯化血红素DNA酶是G四链体和氯化血红素结合而成的具有过氧化氢酶活性的复合物，近年来迅速发展，广泛应用于生物识别和生物传感[26]。 其中，G四链体是由富含鸟嘌呤（G）的DNA序列折叠形成的一种特殊的二级结构[27]。 作为一种人工模拟酶，它具有化学性质稳定、反应高效、易于合成修饰和价廉易得等优点[28]。 G四链体-氯化血红素DNA酶可以催化过氧化氢氧化TMB反应，产生肉眼可见的颜色变化[29]。 利用它的这一特性，可以起到信号放大的功能，达到可视化分析。 我们可以利用探针和靶标结合时引起DNA二级结构的变化导致G四链体的生产或者破坏，从而产生明显的颜色变化信号，来达到检测靶标的目的。 参考文献[1]Bartel DP. 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