抗Dll4人源化抗体的构建和表达文献综述

一 研究的内容

• 抗肿瘤新生血管形成成为肿瘤综合治疗的重要策略之一，研究最多也最具有价值的是通过阻断血管内皮生长因子（VEGF)及其主要受体（VEGF2)来达到抑制肿瘤新生血管形成的目的。但临床实践证明多种肿瘤对VEGF抑制有拮抗作用，肿瘤生成和血管生成并不能受到抑制，Notch信号途径中的一个重要配体（DLL4），在肿瘤血管生成中发挥负性调节，抑制肿瘤组织中DLL4过度表达将导致肿瘤组织生成大量无功能的新生血管，造成肿瘤组织供血不足，最终导致肿瘤生长受到抑制，这为肿瘤治疗提供了新的思路和方法。

Dll4/Notch信号在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。Dll4通过与Notch受体的相互作用，一方面与VEGF通路联合调控肿瘤新生血管的生成，为肿瘤组织提供血流与营养物质；另一方面通过促进肿瘤干细胞自我更新与增殖，维持肿瘤组织的持续生长。因此，抑制Dll4/Notch的传导可以成为肿瘤治疗的新策略。目前，针对Dll4/Notch信号传导的抑制剂主要有RNAi、gamma;分泌酶抑制剂、抗Notch单克隆抗体和抗Dll4单克隆抗体。

本实验的研究对象为以重组人Delta like4（rhDll4）配体为免疫原，通过杂交瘤技术制备的抗rhDll4鼠单克隆抗体，调取其重链、轻链可变区基因进行人源化改造，设计合成4种重链可变区基因（VH-CDR、VH-BK1、VH-BK2、VH-BK3）和3种轻链可变区基因（VL-CDR、VL-BK1、VL-BK2）。本实验的主要内容即将该重链、轻链可变区基因分别克隆到对应的含有人IgG1重链、轻链恒定区的表达载体中，将构建成功的重、轻链表达载体共转染CHO细胞，使其表达7种人源化抗体。吸取转染细胞上清做Western blot，验证抗体的表达；ELISA法测定抗体与抗原的结合能力。选取表达量高、亲和力高的人源化DLL4抗体进行下一步研究。

二 采用的研究手段

1 DNA限制性内切酶酶切和DNA片段的连接

限制性内切酶EcoRⅠ和NheⅠ同时双酶切重链可变区基因(VH-CDR、VH-BK1、VH-BK2、VH-BK3)和重链恒定区基因表达载体（H-PCA、H-PMH3）；限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ同时双酶切轻链可变区基因（VL-CDR、VL-BK1、VL-BK2）和轻链恒定区基因表达载体。1%琼脂糖凝胶电泳分离目的条带并切胶回收，将目的片段与载体按3:1摩尔比进行连接反应。

2 连接产物转化DH5alpha;

3 菌落PCR验证

将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。在扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料，电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。