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课题性质 |
radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究 |
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 拟研究或解决的问题：鉴于目前发现的NAE抑制剂多为天然产物。开发出新型、高效、低毒的小分子NAE抑制剂迫在眉睫。本课题根据课题组前期虚拟筛选的化合物LZ3为先导化合物设计合成了一系列的新型的NAE抑制剂。 采取的研究手段：药物化学合成，计算机辅助药物设计。 NEDD8抑制剂的研究进展 研究表明，几乎所有肿瘤的发生与发展都与细胞内一种或多种蛋白的非正常表达有关[1,2]。与正常细胞相比，肿瘤细胞由于有丝分裂的速度较快，其调控细胞生长和增殖的相关蛋白往往都存在不同程度的过度表达，而与之相对应的是，多种参与诱导正常细胞衰老和凋亡的调节蛋白却在肿瘤细胞中表达较低或活性受到抑制[3]。而这种极不均衡的细胞蛋白表达状态则被认为是癌症发生的根源所在。因此，通过药物分子定向地调解表达失控的蛋白正逐渐成为目前肿瘤治疗中的主流策略。到目前为止，大多数靶向抗肿瘤药物主要是通过直接调节异常表达的蛋白而发挥药效作用[4-6]。然而，由于细胞内普遍存在多条代偿性通路以及酶的再生，该类药物普遍存在严重的耐药性问题[7,8]。因此，越来越多的科学家们将目光投向了利用调节蛋白降解从而间接控制目标蛋白生物活性的新方向[9]。 UPS是细胞蛋白质平衡的主要调解者，参与了细胞内超过80%的蛋白质降解，因此它在维持细胞的正常生理功能方面发挥着极其重要的作用[10-12]。UPS主要由5种重要的蛋白或酶组成，其中包括泛素分子、泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）以及蛋白酶体[13]。E1、E2和E3是UPS中调控底物蛋白泛素化过程的3种关键酶。蛋白质的泛素化过程通常为：E1首先在ATP的参与下激活泛素分子，从而利用其活性半胱氨酸巯基与泛素分子的末端甘氨酸形成高能硫酯键，然后被激活的泛素分子通过一个酯交换反应从E1转移至E2，与E2的半胱氨酸巯基形成新的硫酯键，最后，在E3的协同作用下，与E2相连的泛素分子可以特异性识别目标底物，并通过异肽键与底物蛋白中的赖氨酸共价相连，从而使目标蛋白泛素化（图1）。被泛素化的底物蛋白最终都会被UPS中位于最下游的蛋白酶体所识别进而完成降解。因此蛋白酶体在整个UPS中具有不可替代的作用。 图1：泛素蛋白酶体通路 UPS的调节可以有效地控制细胞内各种蛋白的生理功能，影响细胞生长、分化、凋亡等多个阶段。因此，它已成为继蛋白激酶家族之后的又一类新的药物靶。 目前已有部分UPS抑制剂陆续进入临床实验，其中Bortezomib/VELCAND和carfilzomib分别于2003年和2012年上市。PR-047/ONX0912与CEP18770处于phase1/2，MLN9708、MG-132、GDC-0152等处于Phase I（图2）。
图2：目前进入临床的UPS抑制剂结构 除泛素化过程外，UPS中还包括了其它多种与蛋白泛素化相似的底物修饰过程，人们将其统称为类泛素化过程，而其各自对应的修饰化蛋白则被称为类泛素蛋白（UBLs）。 迄今为止，已经发现有10种UBLs，它们分别是小分子泛素相关修饰物（SUMO）、泛素交叉反应蛋白（ISG15）、泛素相关修饰物（URM1）、神经元前体细胞生长下调蛋白8（NEDD8）、F-人白细胞抗原（FAT10）、 自体吞噬相关基因蛋白8和12 （ATG8 和ATG12）、Fau类泛素蛋白（FUB1）、泛素折叠修饰物1（UFM1）、类泛素蛋白5（UBL5）以及膜连接泛素折叠蛋白（MUB）[14]。 其中较为典型的是NEDD8。 NEDD8蛋白是所有10种UBLs中与泛素同源性最高的标记蛋白。有趣的是，蛋白质的NEDD化也是E3最大亚家族CRL激活的关键步骤。CRL家族包括超过100种E3，它们共同调控着数以百计底物蛋白在细胞内的动态平衡，而其中包括多种与肿瘤细胞的生长和增殖直接相关的蛋白如p21、p27以及Cdt1等[9]。因此相对于E1的抑制，通过选择性地抑制NEDD8通路进而调解CRL的活性将会更加有利于避免普遍性蛋白降解抑制导致的潜在毒副作用。 NEDD8激活酶（NAE）是UPS中NEDD8信号通路的起始酶和关键酶。在细胞内，NEDD8通路可利用其对底物NEDD化状态的调节控制着多种蛋白的生理活性，而其中cullin RING Ligases（CRLs）泛素连接酶尤为重要。CRLs是泛素连接酶中最大的亚家族，它调控着多种与肿瘤发生和发展直接相关的蛋白（如Cdt1、p27及p21等）在细胞内的降解过程。因此，靶向性作用NAE，并利用其对CRLs活性的调节，控制细胞内多种蛋白的平衡已逐渐成为抗肿瘤药物研究的新方向。 2009年 Millennium公司报道了首个选择性NAE抑制剂MLN4924[15]。MLN4924是一种腺苷氨基磺酸类化合物（图3），其对NAE的抑制机理是一种特殊的底物协同作用。首先，MLN4924进入NAE的ATP结合口袋使分子在空间上靠近NEDD8的碳末端，然后利用分子内磺酰胺基与NEDD8末端甘氨酸羧基发生亲核加成-消除反应，使得MLN4924成功地与NEDD8形成共价加成物。该复合物是一种高效的NAE抑制底物，它能够显著地抑制细胞内NEDD8通路，降低其细胞内底物蛋白尤其是CRL的NEDD化水平[15]。在体外酶实验中，MLN4924展现了对NAE极高的亲和力，其IC50高达4 nM。并且更加令人惊喜的是，MLN4924对其它泛素及类泛素激活酶并未表现出明显的抑制作用（IC50其它/IC50 NAE gt; 1000），这种药效作用的高度专一性也为对其进一步研发奠定了良好的基础。在动物肿瘤模型中，MLN4924能够通过稳定Cdt1、p21和p27等底物蛋白，诱导肿瘤细胞DNA复制的失调以及细胞凋亡，进而显著地降低肿瘤细胞的存活率[16]。目前该药物已进入临床I/II期研究，用于治疗多种淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。
图3 已报道的NAE抑制剂 此外，随着近年来分子模拟技术的日益成熟，虚拟筛选技术已被广泛被运用于先导化合物的发现中。通过该项技术，自2011年以来人们已发现两种结构各异的NAE抑制剂。化合物1和6,6rsquo;–biapigenin均来源于天然产物，体外酶实验表明它们对NAE具有一定的抑制活性（IC50 = 0.8-20 mu;M），并且两者都可与ATP竞争性结合于NAE的腺苷口袋，从而可逆地抑制NAE的活性[17,18]。 综上所述，UPS对细胞的多种生理功能均具有广泛的调节作用，而UPS的失调将会直接或间接地导致如癌症、帕金森综合症、艾尔兹海默综合症、病毒感染等多种疾病的发生与发展。因此靶向性调节UPS系统已逐渐成为治疗包括癌症在内的多种顽固疾病的新方法。然而与蛋白激酶系统类似，UPS系统中的各种功能酶也普遍存在着功能重叠、活性位点结构类似、蛋白-蛋白结合域结构复杂等特点，这使得以该系统为靶点的药物研发面临着极大的挑战。但值得庆幸的是，随着硼替佐米和卡非佐米的成功上市，目前已有相当数量的UPS功能调节剂进入了临床研究，其中主要集中在蛋白酶体抑制剂、泛素连接酶抑制剂以及NAE抑制剂等三大类药物。 相对于前两类抑制剂，NAE抑制剂由于其对细胞功能调节的高度选择性和可控性，正越来越多地被用于多种癌症的治疗试验中。目前，已知的NAE抑制剂结构种类和作用机制还十分单一，使得该类药物对临床研究中已报道的耐药突变缺乏有效的应对策略[19]。因此开展新型NAE抑制剂的研究对于丰富该靶点抑制剂的结构种类以及克服现有药物的耐药性都具有十分重要的理论和实践意义。 本课题根据前期虚拟筛选得到的化合物LZ3进行结构改造（图4），得到一系列的化合物，并对其进行合成。 图4：LZ3的结构改造 参考文献 [1] Stratton M R, Campbell P J, Futreal P A. The cancer genome [J]. Nature, 2009, 458(7239): 719-724. [2] Easty D J, Herlyn M, Bennett D C. Abnormal protein tyrosine kinase gene expression during melanoma progression and metastasis [J]. Int J Cancer, 1995, 60(1): 129-136. [3] Xolalpa W, Perez-Galan P, S RodrAguez M, et al. Targeting the ubiquitin proteasome system: beyond proteasome inhibition [J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(22): 4053-4093. [4] Capdeville R, Buchdunger E, Zimmermann J, et al. Glivec (STI571, imatinib), a rationally developed, targeted anticancer drug [J]. Nat Rev Drug Discov, 2002, 1(7): 493-502. [5]Kelly W K, Marks P A. Drug insight: histone deacetylase inhibitors-development of the new targeted anticancer agent suberoylanilide hydroxamic acid [J]. Nat Clin Pract Oncol, 2005, 2(3): 150-157. [6]Ubersax J A, Woodbury E L, Quang P N, et al. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1 [J]. Nature, 2003, 425(6960): 859-864. [7]Wang Y C, Morrison G, Gillihan R, et al. Different mechanisms for resistance to trastuzumab versus lapatinib in HER2-positive breast cancers–role of estrogen receptor and HER2 reactivation [J]. Breast Cancer Res, 2011, 13(6): 121. [8]Corcoran R B, Ebi H, Turke A B, et al. EGFR-mediated reactivation of MAPK signaling contributes to insensitivity of BRAF-mutant colorectal cancers to RAF inhibition with vemurafenib [J]. Cancer discovery, 2012, 2(3): 227-235. [9]Zhang W, Sidhu S S. Development of inhibitors in the ubiquitination cascade [J]. FEBS Lett, 2014, 588(2): 356-367. [10]Hershko A, Heller H, Elias S, Ciechanover A. Components of ubiquitin-protein ligase system. Resolution, affinity purification, and role in protein breakdown [J]. J Biol Chem, 1983, 258 (13): 8206-8214. [11]Husnjak K, Dikic I. Ubiquitin-binding proteins: decoders of ubiquitin-mediated cellular functions [J]. Annu Rev Biochem, 2012, 81: 291-322. [12]Al-Hakim A, Escribano-Diaz C, Landry M.C, et al. The ubiquitous role of ubiquitin in the DNA damage response [J]. DNA Repair, 2010, 9(12): 1229-1240. [13]Bedford L, Lowe J, Dick L R, et al. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin–proteasome system as drug targets [J]. Nat Rev Drug Discov, 2011, 10(1): 29-46. [14]De la Cruz NB, Peterson FC, Lytle BL, et al. Solution structure of a membrane-anchored ubiquitin-fold (MUB) protein from Homo sapiens [J]. Protein Sci, 2007, 16(7): 1479-84. [15]Brownell J E, Sintchak M D, Gavin J M, et al. Substrate-assisted inhibition of ubiquitin-like protein-activating enzymes: the NEDD8 E1 inhibitor MLN4924 forms a NEDD8-AMP mimetic in situ [J]. Mol Cell, 2010, 37(1): 102-111. [16]Lin J J, Milhollen M A, Smith P G, et al. NEDD8-targeting drug MLN4924 elicits DNA rereplication by stabilizing Cdt1 in S phase, triggering checkpoint activation, apoptosis, and senescence in cancer cells [J]. Cancer Res, 2010, 70(24): 10310-10320. [17]Leung C H, Chan D S H, Yang H, et al. A natural product-like inhibitor of NEDD8-activating enzyme [J]. Chem Commun, 2011, 47(9): 2511-2513. [18]Zhong H J, Pui-Yan Ma V, Cheng Z, et al. Discovery of a natural product inhibitor targeting protein neddylation by structure-based virtual screening [J]. Biochimie, 2012, 94(11): 2457-2460. [19]Milhollen M A, Thomas M P, Narayanan U, et al. Treatment-emergent mutations in NAEbeta; confer resistance to the NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924 [J]. Cancer cell, 2012, 21(3): 388-401. |
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