套索肽Capistruin生物合成关键酶的异源表达及鉴定文献综述

1. 拟研究或解决的问题

Capistruin是一种来源于革兰氏阴性菌Burkholderia thailandensis E264(ATCC number: 700388）具有抗菌活性的套索肽，可以通过抑制RNA聚合酶的活性发挥其抗菌活性，尤其是对绿脓假单胞菌的RNAP有较强特异性。Capistruin生物基因簇capABCD（大小约4.5kb），能合成CapA、CapB、CapC和CapD四种蛋白质，这四种蛋白质的大小和功能均不相同。其中capA基因表达CapA前体肽，它包括28个氨基酸的前导肽和19个氨基酸的核心肽。本次实验通过在E.coli异源表达基因簇中的capB基因，纯化获得CapB蛋白，确定Capistruin生物合成途径的关键酶，研究套索肽翻译后修饰机制，为在体外完成酶催化合成套索肽Capistruin奠定基础。

1. 拟采用的研究手段及技术路线

2.1 研究手段

1. 从革兰氏阴性菌Burkholderia thailandensis E264（ATCC: 700388）中提取基因组DNA。
2. 采用PCR手段克隆目的基因capB，并构建原核表达载体pET28a-His₆-capB。
3. 将质粒pET28a-His₆-capB转化到E.coli BL21（DE3）中进行异源表达。
4. 通过SDS-PAGE电泳和Western Blot的方法检测目标产物。
   1. 技术路线

1. 文献综述

3.1 套索肽的结构、分类及功能

套索多肽所共有的特点是：有一个由8或9个氨基酸构成的异肽键的“环”，其后跟随一个C端的直线部分。套索多肽的C端穿过环形成一个“钩”和一个“尾巴”，它的名称也因由此形成的像套索一样的结构而得，其N端部分的氨基酸是甘氨酸或者半胱氨酸，而用来闭合环的氨基酸必须是天冬氨酸或谷氨酸。

套索多肽是一类由核糖体合成并经过翻译后修饰形成的天然小分子肽类，具有抗菌活性、受体拮抗剂以及酶抑制剂等多种生物活性。大量的翻译后修饰让这些多肽的结构不易被天然的核糖体多肽直接接近。套索肽通过限制构象的灵活性来达到更好的靶向识别作用，提高自身新陈代谢和化学的稳定性，增加其化学功能。

根据成环氨基酸不同，套索肽可分为三类，ClassⅠlasso peptides：在位点1为Cys，并包括四个Cys残基，含有两个二硫键。ClassⅡ lasso peptides：在位点1是Gly，没有Cys残基，目前研究较为热门的是其中一种新的套索肽Capistruin（来自于Burkholderia thailandensis E264）；Class Ⅲ lasso peptides：在位点1为Gly，并包括两个Cys形成一个二硫键（图1）。

图1. 套索肽的三种基本类型

3.2 套索肽的研究进展

套索多肽是核糖体合成的一个结构独特的蛋白家族（Rebuffat et al.，2004；Severinov et al.，2007）。正如它们的名字，这些多肽具有像螺旋的套索或者一个活结样子的拓扑结构，它们在复杂的生物环境中发挥作用。20年前，第一个套索多肽anantin被分离得到并定性研究，它是在筛选天然的房性排钠受体的拮抗剂中被发现的。后来，在寻找天然生物活性物质的过程中，以类似的方式发现了Propeptin，RP71955，siamycin1/2，RES-701-1，BI-32169，lariatins和MccJ25。

套索多肽Anatin是一种从Streptomyces coerulescens中分离得到的17个残基大小的多肽，它能够抑制房性排钠利尿因子受体，而类似的研究发现它不具有抗细菌或者抗真菌的活性。RP71955能抑制HIV-1天冬酰胺蛋白酶和HIV病毒反转录，科学家发现它对一种格兰氏阴性菌和几种格兰氏阳性菌也有抑制作用。Siamycins 1和2在对B.subtilis、S.aureus和Micrococcus luteus以及格兰氏阴性菌E.coli Juhl的有类似抗性。RES-701-1是一个选择性的内皮肽B型受体的拮抗剂。在细胞功能水平的实验中，BI-32169显示出对人胰高血糖素受体有效的抑制能力（IC50值分别是440和320nm）。而MccJ25的功能是多层面的，已经发现了将近100种仍保持抗菌功能的变异型MccJ25。